Dreidimensionale Bildgebung von immunmarkierten Astrozyten mittels konfokaler Mikroskopie

Abstract

Quelle:

Protocol

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.

1. Tiere, Chirurgie und Probenvorbereitung

HINWEIS: Bereiten Sie das Hirngewebe für die dreidimensionale (3D) konfokale mikroskopische Analyse vor.

1. Die Tiere werden nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen eingeteilt: Amyloid beta (Aβ)_{1-40-Injektion} (n = 8) und Aβ_{1-40-Injektion} mit Genistein-Behandlung (n = 8); Verabreichen Sie Genistein (10 mg/kg verdünnt in einem Vehikel, wie z. B. polyethoxyliertem Rizinusöl) 1 Stunde vor der Operation per Sonde.
2. Betäuben Sie die Tiere mit Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg). Bestätigen Sie die richtige Anästhesie durch das Fehlen eines Entzugsreflexes nach dem Einklemmen des Zehs. Verwenden Sie während der Operation Salbe auf die Augen, um Trockenheit zu vermeiden.
3. Die Tiere werden in stereotaktische Apparate gelegt und der Kopf geschoren. Tragen Sie Jodlösung auf, um die Kopfhaut vor dem Schnitt zu reinigen, und halten Sie die Operationsstelle während der Operation steril, um das Infektionsrisiko zu verringern. Aβ_1-40 wird stereotaktisch (4 μl) in den Hippocampus bei -3,5 mm posterior des Bregmas, ± 2 mm lateral der Mittellinie und -2,8 mm unterhalb der Dura injiziert, so der Rattenhirnatlas.
4. Führen Sie eine postoperative Beobachtung/Pflege durch, bis die Tiere bei vollem Bewusstsein sind, um das Wohlbefinden der Tiere zu gewährleisten. Halten Sie die Tiere während der Genesung warm und setzen Sie sie bis zur vollständigen Genesung nicht mit anderen Tieren in einen Käfig zurück. Achten Sie nach der Operation auf Anzeichen einer Infektion bei den Tieren.
5. Betäuben Sie die Tiere drei Wochen nach der Operation tief mit Ketamin (150 mg/kg). Führen Sie eine transkardiale Fixierung durch, indem Sie die Tiere mit 0,9 % Kochsalzlösung gefolgt von 4 % Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer-Kochsalzlösung oder PBS (pH = 7,4) perfundieren, dann das Gehirn entfernen und fixieren.
6. Postfixieren Sie das Gehirn 2-3 Tage lang bei 4 °C in 4% Paraformaldehyd.
7. Betten Sie das Gewebe mit Hilfe von Gewebeeinbettungsgeräten in Paraffinblöcke ein und vermeiden Sie eine Unter- oder Überfüllung der Kassette, da dies die korrekte Ausrichtung oder Teilung beeinträchtigen kann. Achten Sie auf die Ausrichtung des Gewebes im Paraffinblock.
   HINWEIS: Der Hippocampus der Ratte befindet sich beispielsweise in der Nähe des hinteren Teils der Gehirnhälfte. Daher sollte das Gewebe so eingebettet werden, dass die Schnitte im hinteren Teil des Gehirns beginnen. Nutzen Sie den Paxinos-Atlas als Anhaltspunkt, um die gewünschte anatomische Struktur zu erreichen.
8. Stellen Sie das Mikrotom fern von Zugluft oder Türen auf, da Luftbewegungen die Handhabung der Abschnitte erschweren.
9. Verwenden Sie Schnitte mit einer Dicke ≥20 μm, da diese Tiefe erforderlich ist, um Z-Stack-Bilder von vollständigen Astrozyten zu erstellen. Verwenden Sie nicht die ersten Abschnitte, da sie aufgrund der Wärmeausdehnung eine unerwünschte Dicke aufweisen können.
10. Legen Sie die Abschnitte auf die Oberfläche von warmem Wasser (5 ± 2 °C, unter der Schmelztemperatur für Paraffin), gerade lange genug, um die Abschnitte abzuflachen.
    HINWEIS: Eine Überdehnung des Abschnitts kann die Morphologie der Struktur stören. Verwenden Sie einen winzigen Pinsel, um die Abschnitte vorsichtig zu übertragen. Sammeln Sie zwei bis drei Abschnitte auf jeder Folie.
11. Lagern Sie die Objektträger in einem aufrechten Gestell und lassen Sie sie mehrere Stunden oder über Nacht bei 37 °C trocknen.

2. Immunhistochemie

1. Entparaffinisieren Sie Schnitte in Xylol, 2 x 10 min, und rehydrieren Sie durch Alkoholgradient (99,8 %, 95 % und 70 %, jeweils 10 min) und PBS.
2. Inkubieren Sie mit Antikörpern gegen saures Gliafibrillärprotein (GFAP), verdünnt im Verhältnis 1:1.500 in PBS, das 0,25 % Rinderserumalbumin (BSA), 0,25 % Triton X-100 und 3,5 % normales Serum (O/N bei 4 °C) enthält.
3. Waschen Sie die Abschnitte in PBS für 3 x 5 min.
4. Inkubieren Sie mit sekundären alkalischen phosphatkonjugierten Antikörpern für 1 h (1:100, 21 °C, verdünnt in PBS).
5. Waschen Sie die Schnitte 3 x 5 Min. lang in PBS.
   HINWEIS: Es ist wichtig, die Schnitte nach Sekundärantikörpern richtig zu waschen, um Hintergrundflecken zu minimieren.
6. Inkubieren Sie die Schnitte im Dunkeln mit Liquid Permanent Red Chromogen (15-20 min).
   Hinweis: Bereiten Sie die Lösung nicht länger als 30 Minuten vor Gebrauch vor.
7. Waschen Sie die Abschnitte in PBS für 3 x 5 min.
8. Zum Schluss färben Sie die Zellkerne mit 4-6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI; 1:500, verdünnt in PBS), bevor Sie sie abdecken. Bewahren Sie die Objektträger vor der Mikroskopie 24-48 Stunden im Kühlschrank auf.

3. Konfokale Mikroskopie

HINWEIS: Für die quantitative Auswertung (siehe unten) wählen Sie einen Astrozyten mit einem deutlich sichtbaren DAPI-gefärbten Zellkern mit einem Minimum an überlappenden Ästen, um das Fehlerrisiko zu verringern. Das Erstellen von Z-Stack-Images ist zeitaufwändig. Seien Sie geduldig und hören Sie während der Verarbeitung nicht auf. Ein aufrechtes konfokales Laser-Scanning-Mikroskop wird verwendet, um 3D-Bilder von Astrozyten zu erstellen.

1. Legen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch und wählen Sie das 63X-Objektiv aus.
2. Öffnen Sie die Imaging-Software und klicken Sie auf System starten. Klicken Sie auf die Registerkarte Suchen. Gehen Sie zu Zuweisen und wählen Sie GFP, um das richtige Licht einzustellen.
3. Öffnen Sie den Verschluss, um das Licht zu reflektieren. Finde den Reflektorrevolver auf der rechten Seite des Verschlusses und wähle die Farbe, die von den Astrozyten reflektiert werden soll (grün, rot oder violett); Hier wurde rote Farbe (FSet20 wf) verwendet.
   HINWEIS: Vergessen Sie nicht, das Bild direkt im Okular des Mikroskops zu fokussieren.
4. Um den besten Fokus zu finden, klicken Sie auf Alle geschlossen, versetzen Sie den Mikroskopstift in den Bildschirmmodus und klicken Sie auf die Registerkarte Erfassung.
5. Klicken Sie auf Smart Setup unter der Registerkarte Erfassung; es öffnet sich ein Fenster. Wählen Sie das richtige Fluorophor (d. h. DAPI und Alexa Fluor 555 im aktuellen Projekt) aus der Liste aus. Die Farbe wird automatisch ausgewählt.
6. Klicken Sie auf Bestes Signal und Anwenden, dann auf Set Exposure; der Computer stellt dann automatisch die Belichtungsparameter ein.
7. Um das Bild zu optimieren, gehen Sie zum Fenster Kanäle. Deaktivieren Sie Spur2, markieren Sie Spur1 und klicken Sie auf Live. Fokussieren Sie sich bei Bedarf auf das Bild.
8. Stellen Sie im Kanalfenster die folgenden Tasten ein: Klicken Sie auf 1AU, um die Lochblende automatisch zu optimieren. Es ist sehr wichtig, diesen Schritt durchzuführen, da sonst die konfokalen Bilder nicht optimal sind. Passen Sie die Verstärkung an, um die beste Intensität zu erzielen (halten Sie diese Einstellung unter 800, um zusätzliches Rauschen zu reduzieren). Stellen Sie abschließend den Digital Gain zwischen 2 und 3 ein.
9. Heben Sie die Markierung von Spur1 auf, klicken Sie auf Spur2 und wiederholen Sie Schritt 3.8 für Spur2. Stoppen Sie dann Live.
10. Wechseln Sie zum Fenster Erfassungsmodus. Verbessern Sie das Bild, indem Sie die Bildgröße und die Mittelwertbildung optimieren. Um die Framegröße zu ändern, gehen Sie zu X*Y und wählen Sie 1.024 x 1.024 aus. Wählen Sie eine langsame Geschwindigkeit, um ein besseres Bild zu erstellen.
11. Gehen Sie zu Mittelwertbildung und wählen Sie eine Zahl ≥4 aus. Dieser Mittelungswert gibt die Anzahl der Scans an, die gemittelt werden, um das erfasste Bild zu erzeugen. Klicken Sie nun auf die Schaltfläche Snap und speichern Sie das aufgenommene 2D-Bild.
12. Markieren Sie für 3D-Bildgebung das Element Z-Stapel unter Intelligente Einrichtung, woraufhin das Fenster Z-Stapel geöffnet wird.
13. Legen Sie die erste und letzte Position für den Z-Stack fest, d.h. die Tiefe der Zelle. Klicken Sie zunächst auf Live. Fokussieren Sie dann mit dem Fokusantrieb des Mikroskops auf die oberste Position des Astrozyten im Gewebe, wo der Z-Stack beginnen soll. Klicken Sie auf Zuerst festlegen. Fokussieren Sie dann auf die unterste Position des Astrozyten im Gewebe, wo das Z-Stack-Scannen gestoppt werden sollte. Klicken Sie auf Zuletzt festlegen. Stoppen Sie dann Live.
14. Wählen Sie das Intervall; in der aktuellen Studie wird 1,01 μm verwendet; die Auswahl des Intervalls kann durch Klicken auf Optimal erfolgen, um die Anzahl der Schichten festzulegen.
15. Klicken Sie auf Experiment starten. Speichern Sie die Bilder, sobald der Scan abgeschlossen ist. Dieses Bild wird für die Messung der folgenden Parameter verwendet: Oberfläche und Volumen des Astrozytenterritoriums sowie des gesamten Astrozyten, einschließlich Äste, Zellkörper und Zellkern.

Materials