Gezielte siRNA-Verabreichung an Neuronen für das Silencing von Prionenproteinen mit liposomalen Komplexen

Zusammenfassung

Quelle: Bender, H. R., et.al. Verabreichung von therapeutischer siRNA an das ZNS unter Verwendung von kationischen und anionischen Liposomen. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt die gezielte Verabreichung von Prionprotein (PrP) siRNA an Neuronen unter Verwendung von liposomalen siRNA-Peptid-Komplexen (LSPCs). Kationische Liposomen binden elektrostatisch PrP-zielende siRNA, die durch das RVG-9r-Peptid für den Rezeptor-vermittelten Transport durch die Blut-Hirn-Schranke weiter stabilisiert wird. Sobald sie sich im Gehirn befinden, durchlaufen LSPCs eine Endozytose in Neuronen, wodurch siRNA freigesetzt wird, um RNA-Interferenzen zu initiieren, die PrP-Expression zu reduzieren und das Fortschreiten der Prionenkrankheit zu unterbrechen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Zubereitung von LSPCs

1. Verwenden Sie ein DOTAP (1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propan): Cholesterinverhältnis von 1:1 für LSPCs. Für ein Liposomenpräparat mit 4 nmol werden 2 nmol DOTAP und 2 nmol Cholesterin in 10 ml einer 1:1 Chloroform:Methanol-Lösung in einem Kolben gemischt.
2. 9 ml der Chloroform:Methanol-Lösung mit N₂ -Gas in einem Abzug verdampfen. Die letzten 1 ml Lösungsmittel in einem Abzug über Nacht ohne Gas verdampfen. Beobachten Sie einen dünnen Lipidfilm auf dem Boden des Kolbens.
3. 10 ml einer 10%igen Saccharoselösung auf 55 °C erhitzen.
4. Gießen Sie die erhitzte 10%ige Saccharoselösung langsam, d.h. 1 ml/min, auf den dünnen Lipidfilm, während Sie den Kolben vorsichtig schwenken. Die 10%ige Saccharose und der Kolben mit den Lipiden werden auf 55 °C gehalten, so dass die Lipidmoleküle in der Gel-Flüssig-Phase verbleiben. Die Rehydratation führt zur Bildung von multilamellären Vesikeln (MLV).
5. Lassen Sie die Lipide mindestens eine Stunde lang bei 55 °C rehydrieren, bevor Sie die Liposomen dimensionieren.
6. Montieren Sie einen Extruder nach Herstellerangaben mit 1,0 μm Filtern oder verwenden Sie 1,0 μm Spritzenvorsatzfilter für die Schlichte.
7. Geben Sie 1 ml der erhitzten Liposomensuspension in eine der Spritzen am Extruder und schieben Sie die Suspension 11 Mal zwischen den beiden Spritzen hindurch. Stellen Sie sicher, dass sich die Suspension in der entgegengesetzten Spritze befindet als die Startspritze, nachdem die 11 durchgegangen sind.
8. Dimensionieren Sie die Liposomen erneut durch 0,45 μm und dann 0,2 μm Filter, um große unilamellare Vesikel (LUVs) zu erzeugen. Halten Sie die Liposomensuspension erhitzt, um die Größenbestimmung zu erleichtern.
9. Inkubieren Sie 20 μl der 4-nmol-Liposomensuspension (200 μM) mit 200 μl einer 20 μM (4 nmol insgesamt) SiRNA-Stammlösung für 10 min bei Raumtemperatur.
10. Inkubieren Sie 80 μl einer 500 μM (40 nmol insgesamt) RVG-9r-Stammlösung mit der siRNA/Liposomen-Lösung für 10 min bei RT. LSPCs sollten so bald wie möglich verwendet werden, können aber bis zu mehreren Stunden nach der Zubereitung verwendet werden. Lagern Sie LSPCs nach der Zubereitung mehrere Stunden lang bei 4 °C.

2. Injektion von Mäusen mit LSPCs

1. : Setzen Sie die Mäuse 5-10 Minuten lang einer Wärmelampe aus, um das Gefäßsystem zu erweitern.
2. Betäuben Sie die Maus 5-10 Minuten vor der Injektion und während der Injektion mit einem 2-3%igen Isofluoran/Sauerstoff-Fluss. Bestätigen Sie die Anästhesie, wenn das Tier nicht mehr gehfähig ist und sich die Atmung verlangsamt hat, indem Sie die Zehen kneifen. Platzieren Sie die Maus auf dem Rücken oder auf der Seite, um an die Schwanzvene zu gelangen. Verwenden Sie Tierarztsalbe auf den Augen der Maus, um ein Austrocknen unter Narkose zu verhindern.
3. Wischen/besprühen Sie den Schwanz mit 70 % EtOH und injizieren Sie 300 μl LSPCs mit einer 26-G-Insulinspritze in die Schwanzvene der Maus. Beginnen Sie mit der distalen Injektion in die Schwanzvene und bewegen Sie sich proximal, wenn die Vene kollabiert oder reißt.
4. Setzen Sie die Maus in einen sauberen Käfig, bis sie die Brustbeinlage beibehält. Platzieren Sie die Maus nicht zu anderen Käfiggenossen, bis sie sich vollständig erholt hat. Die Mäuse sollten sich in 5 bis 15 Minuten erholen. Sie können auf ein Heizkissen oder unter eine Wärmelampe gelegt werden, um die Körpertemperatur zu halten, wenn die Genesung länger dauert. Mäuse sollten engmaschig überwacht werden, um sich vor Überhitzung zu schützen.
5. Überwachen Sie das Tier einige Stunden nach der Injektion, um sicherzustellen, dass die Anästhesie nachlässt und keine negativen Auswirkungen der Behandlung auftreten. Lassen Sie die LSPCs mindestens 24 Stunden lang zirkulieren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DOTAP lipid	Avanti Lipids	890890
Cholesterin	Avanti Lipids	700000
Chloroform	Fisher Scientific	AC268320010
Methanol	EMD Millipore	113351
N₂ Gas	AirGas
Saccharose	Fisher Scientific	S5-500
Extruder	Avanti Lipide	610023
0,4 und 0,2 μm Filter	Avanti Lipids	610010, 610007, 610006

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