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Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.
1. Ki67 Zellproliferationsassay
- Ki67 Zellproliferationsassay (Immunzytochemie)
- Spülen Sie die Zellkulturen zweimal eine Minute lang mit 0,1 M Phosphat (PO4) Puffer. Fixieren Sie die Kultur mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das PFA und spülen Sie die Vertiefungen dreimal sieben Minuten lang mit PBS.
- Nach dem letzten Spülen 100 μl Blockerlösung (Phosphatpuffer-Kochsalzlösung, 5 % normales Eselserum, 0,4 % Rinderalbuminserum und 0,2 % Triton X-100) in jede Vertiefung geben und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Bereiten Sie den Primärantikörper, Kaninchen-Anti-Ki67, vor, indem Sie ihn in Blockerlösung im Arbeitsverhältnis von 1:200 verdünnen.
- Entfernen Sie die Blockerlösung und tragen Sie 100 μl der primären Antikörperlösung auf jede Vertiefung auf. Decken Sie die 96-Well-Platte ab und inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 4 °C.
- Entfernen Sie am nächsten Tag die Antikörperlösung und spülen Sie sie 3 Mal 7 Minuten lang mit PBS aus.
- Bereiten Sie den Sekundärantikörper, Esel Anti-Kaninchen Cy3, in Blockierungslösung in einem Arbeitsverhältnis von 1:500 vor. Geben Sie DAPI-Kernfärbung in einer Verdünnung von 1:100 in die Sekundärantikörperlösung. Nach der Entnahme der letzten PBS-Spülung 100 μl der Sekundärantikörper/DAPI-Lösung auf jede Vertiefung auftragen. Bei Raumtemperatur im Dunkeln 90 min inkubieren.
- Entfernen Sie den Sekundärantikörper/die DAPI-Lösung und spülen Sie jede Vertiefung 3 Mal 7 Minuten lang mit PBS aus. Decken Sie die 96-Well-Platte ab und lagern Sie sie bis zur Bildgebung bei 4 °C.
2. Automatisierte Bildgebung und Multiwellenlängen-Scoring-Analyse
- Legen Sie eine 96-Well-Platte (die zuvor für die Ki67-Immunmarkierung verarbeitet wurde) in das HCS-System ein und lassen Sie die Platte 20 Minuten lang äquilibrieren. Öffnen Sie die Bilderfassungs- und Analysesoftware des HCS-Systems.
- Wählen Sie die Aufnahmeeinstellungen für das 10X-Objektiv mit Kamera-Binning bei 1 und einer Verstärkungseinstellung von 2. Finden Sie die Z-Ebene, in der sich die Zellen befinden, indem Sie die Auto-Exposure-Funktion verwenden, und berechnen Sie den Offset für jede gewünschte Wellenlänge. Erfassen Sie für diese Analyse Bilder für DAPI (W1) und Cy3 (W2). Wählen Sie die maximale Intensitätsstufe, bei der die negativen Kontrollvertiefungen kein Signal für die Bildaufnahme anzeigen. Vergewissern Sie sich, dass diese Einstellung für die positiven Vertiefungen geeignet ist.
- Platte erwerben. Erfassen Sie Bilder und speichern Sie sie in der Datenbank der Bilderfassungs- und Analysesoftware.
- Sobald die Bilder aufgenommen wurden, öffnen Sie die Offline-Software für die Bilderfassung und -analyse und überprüfen Sie die Plattendaten aus den oben aufgenommenen Bildern.
- Wählen Sie die Bewertungsanalyse für mehrere Wellenlängen aus. Konfigurieren Sie die minimale und maximale Intensität für jede Wellenlänge.
HINWEIS: Die DAPI-Detektion sollte die Färbung um jeden sichtbaren Kern herum markieren. Cy3 sollte die positiven Zellen mit Ki67-Immunreaktivität (IR) nachweisen und sollte IR unter den Negativkontrollen nicht nachweisen. Für Cy3 Ki67 IR betrug die ungefähre minimale Breite 7 μm, die ungefähre maximale Breite 30 μm, die Intensität über dem lokalen Hintergrund 150 Graustufen und die minimale gefärbte Fläche 50 μm2. - Führen Sie eine Analyse für alle Positionen durch. Exportieren Sie die Daten, um sie in einer Tabelle anzuzeigen.