Dieses Video zeigt den Prozess der Charakterisierung transgener mesenchymaler Stammzellen, die so verändert wurden, dass sie therapeutische neurotrophe Faktoren exprimieren. Es werden die Schritte beschrieben, die bei der Fixierung, Permeabilisierung und Färbung der Zellen mit primären und sekundären Antikörpern erforderlich sind, die auf einen Zellproliferationsmarker abzielen, gefolgt von der Analyse mit einem High-Content-Screening-System, um Fluoreszenzsignale in den Zellkernen zu erfassen. Eine erhöhte Proliferationsmarkerexpression bestätigt die Eignung der transgenen Zellen für neurotherapeutische Anwendungen.
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Methodenartikel
Charakterisierung von gentechnisch veränderten mesenchymalen Stammzellen für neurotherapeutische Anwendungen
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7. August 2025
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.
1. Ki67 Zellproliferationsassay
- Ki67 Zellproliferationsassay (Immunzytochemie)
- Spülen Sie die Zellkulturen zweimal eine Minute lang mit 0,1 M Phosphat (PO4) Puffer. Fixieren Sie die Kultur mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das PFA und spülen Sie die Vertiefungen dreimal sieben Minuten lang mit PBS.
- Nach dem letzten Spülen 100 μl Blockerlösung (Phosphatpuffer-Kochsalzlösung, 5 % normales Eselserum, 0,4 % Rinderalbuminserum und 0,2 % ....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 96-Well-Platten | Greiner Bio One | 655090 | 96-Well-Platten für den Einsatz in ImageXpress |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | A9647 | |
| Kaninchen-Anti-Ki67-Antikörper | Abcam ( Cambridge, MA) | Ab16667 | 1:200 Verdünnung |
| DAPI | Invitrogen (Carlsbad, CA) | D3571 | |
| Esel Anti-Kaninchen Cy3 | Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA) | 711-165-152 | 1:500 Verdünnung |
| Maus MSCs von adulten C57BL/6 Mäusen | Tulane Cent für die Gentherapie (New Orleans, LA) | Isoliert aus Knochenmark | |
| Gentechnisch veränderte MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF) | Diese Zellen wurden aus unserer früheren Studie gewonnen: Ye et. al. (in Vorbereitung) | ||
| Normales Eselserum (NDS) | Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA) | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyd (PFA) | Fisher Scientific (Hampton, NH) | O4042 | 4% PFA in 0,1M PO4-Puffer |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P4417 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | X100 | |
| ImageXpress Micro | Molecular devices (Sunnyvale, CA) | ImageXpress micro | High-Content-Screening-System |
| MetaXpress 4.0 | Molecular devices (Sunnyvale, CA) | MetaXpress 4.0 | Bilderfassungs- und -analysesoftware |
| KH₂PO₄ | Fisher Scientific (Hampton, NH) | P285 | Für PO₄-Puffer |
| K₂HPO₄ | Fisher Scientific (Hampton, NH) | P288 | Für PO₄-Puffer |
