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Charakterisierung von gentechnisch veränderten mesenchymalen Stammzellen für neurotherapeutische Anwendungen

August 7th, 2025

In This Article

Abstract

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Quelle: Sharma, A. D., et.al. Hochdurchsatz-Charakterisierung von adulten Stammzellen, die für die Verabreichung von therapeutischen Faktoren für neuroprotektive Strategien entwickelt wurden. J. Vis. Exp. (2015)

Dieses Video zeigt den Prozess der Charakterisierung transgener mesenchymaler Stammzellen, die so verändert wurden, dass sie therapeutische neurotrophe Faktoren exprimieren. Es werden die Schritte beschrieben, die bei der Fixierung, Permeabilisierung und Färbung der Zellen mit primären und sekundären Antikörpern erforderlich sind, die auf einen Zellproliferationsmarker abzielen, gefolgt von der Analyse mit einem High-Content-Screening-System, um Fluoreszenzsignale in den Zellkernen zu erfassen. Eine erhöhte Proliferationsmarkerexpression bestätigt die Eignung der transgenen Zellen für neurotherapeutische Anwendungen.

Protocol

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Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.

1. Ki67 Zellproliferationsassay

  1. Ki67 Zellproliferationsassay (Immunzytochemie)
    1. Spülen Sie die Zellkulturen zweimal eine Minute lang mit 0,1 M Phosphat (PO4) Puffer. Fixieren Sie die Kultur mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das PFA und spülen Sie die Vertiefungen dreimal sieben Minuten lang mit PBS.
    2. Nach dem letzten Spülen 100 μl Blockerlösung (Phosphatpuffer-Kochsalzlösung, 5 % normales Eselserum, 0,4 % Rinderalbuminserum und 0,2 % ....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96-Well-PlattenGreiner Bio One65509096-Well-Platten für den Einsatz in ImageXpress
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)A9647
Kaninchen-Anti-Ki67-AntikörperAbcam ( Cambridge, MA)Ab166671:200 Verdünnung
DAPIInvitrogen (Carlsbad, CA)D3571
Esel Anti-Kaninchen Cy3Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)711-165-1521:500 Verdünnung
Maus MSCs von adulten C57BL/6 MäusenTulane Cent für die Gentherapie (New Orleans, LA) Isoliert aus Knochenmark
Gentechnisch veränderte MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF)Diese Zellen wurden aus unserer früheren Studie gewonnen: Ye et. al. (in Vorbereitung)
Normales Eselserum (NDS)Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)017-000-121
Paraformaldehyd (PFA)Fisher Scientific (Hampton, NH)O40424% PFA in 0,1M PO4-Puffer
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)P4417
Triton X-100Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)X100
ImageXpress MicroMolecular devices (Sunnyvale, CA)ImageXpress microHigh-Content-Screening-System
MetaXpress 4.0Molecular devices (Sunnyvale, CA)MetaXpress 4.0Bilderfassungs- und -analysesoftware
KH₂PO₄Fisher Scientific (Hampton, NH)P285Für PO₄-Puffer
K₂HPO₄Fisher Scientific (Hampton, NH)P288Für PO₄-Puffer

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Tags

Mesenchymal Stem CellsNeurotrophic FactorsCell Proliferation AssayHigh Content ScreeningImmunofluorescence StainingKi 67 MarkerGFP ExpressionParaformaldehyde FixationSecondary AntibodiesDNA Binding Dye

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