Synergistische Wirkung der intrakraniellen und intraperitonealen Verabreichung von Analgetika auf die thermische Schmerzreaktion bei einer Ratte

Zusammenfassung

Quelle: Martinez, E., et al. Intrakranielle Pharmakotherapie und Schmerztests bei Nagetieren. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video zeigt die intrakranielle Verabreichung eines Analgetikums bei einer anästhesierten Ratte mit einer präimplantierten Führungskanüle im präfrontalen Kortex. Ein zusätzliches Analgetikum wird intraperitoneal gleichzeitig verabreicht. Nach der Genesung wird die thermische Schmerzreaktion der Ratte mit dem Hargreave-Gerät bewertet, wobei die Latenzzeit des Pfotenentzugs gemessen wird, um die analgetische Wirkung der verabreichten Medikamente zu bewerten.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Stereotaktische Kanülenimplantation

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1. Verwenden Sie 10-12 Wochen alte männliche Sprague-Dawley-Ratten.
2. Tiere mit 1,5-2% Isofluran betäuben. Sobald das Tier nicht mehr auf ein starkes Kneifen mit einer scharfen Pinzette reagiert, führen Sie die Operation durch. Achten Sie darauf, alle Instrumente zu autoklavieren, sterile OP-Handschuhe zu verwenden und den Augen des Tieres eine Augensalbe aufzutragen, um Schäden zu vermeiden.
3. Stereotaktische Implantation von bilateralen 26-Gauge-Führungskanülen in den präfrontalen Kortex (PFC) in einem Winkel von 12,5 Grad mit den Koordinaten anteroposterior (AP): +2,9 mm; mediolateral (ML): +/-1,6 mm; dorsoventral (DV): -2,1 mm. Um die Kanülen einzuführen, bohren Sie Löcher in den Schädel an den gewünschten Koordinaten, mit einem Lochdurchmesser, der der Größe der verwendeten Kanülen entspricht.
   HINWEIS: Hier wurde der PFC aufgrund seiner wichtigen Rolle bei der Schmerzverarbeitung, die in einer Reihe früherer Studien gezeigt wurde, als potenzielles Ziel für intrakranielle Implantate untersucht. Um die Funktion anderer spezifischer Hirnareale zu untersuchen, können Forscher unterschiedliche Koordinaten gemäß dem Gehirnatlas verwenden.
4. Lassen Sie die Ratten sich mindestens 1 Woche lang von der Operation erholen. Nach der Operation injizieren Sie vor der Genesung subkutane Flüssigkeiten, um den Stoffwechselbedarf zu unterstützen, und tragen Sie topisches Bupivacain in den frisch verschlossenen Schnitt auf. Legen Sie das Tier bis zum Aufwachen auf ein warmes Polster und überwachen Sie das Tier nach der Operation 3 Tage lang, um eine gute Gesundheit und eine ordnungsgemäße Genesung zu gewährleisten.
5. Sobald sich die Tiere vollständig von der Operation erholt haben, beginnen Sie mit den Injektionen (nächster Schritt).

2. Intrakranielle und intraperitoneale Injektionen

1. Verwenden Sie für intrakranielle Injektionen einen PE-50-Schlauch, der an einem Ende an 10-μl-Hamilton-Spritzen befestigt ist, mit einer 33-Gauge-Injektorkanüle, die 1,0 mm über die implantierten Schablonen hinausragt.
2. Injizieren Sie 0,5 μl (oder weniger, falls gewünscht) des Studienmedikaments oder der Kochsalzlösung in den PFC dieser Ratten. Da der PFC bei Ratten eine größere Region ist, wird diese Menge nicht auf andere Regionen übertragen. Verwenden Sie jedoch für kleinere Gehirnregionen oder für Mäuse ein kleineres Volumen. Die injizierte Menge hängt von der Region des Gehirns und der Tierart ab.
   HINWEIS: Bitte beachten Sie, dass Kochsalzlösung anstelle von Dimethylsulfoxid (DMSO) als Kontrolle verwendet werden sollte, da DMSO neurotoxisch ist. Eine sehr kleine Menge DMSO kann jedoch für die Infusion sicher sein, da Studien gezeigt haben, dass weniger als 50 % DMSO (d. h. weniger als ein Gesamtvolumen von 0,3 μl, wie in diesem Fall) Verhaltensstudien nicht beeinträchtigen können.
3. Das Volumen wird beidseitig über einen Zeitraum von 100 s injiziert und die Injektorkanülen vor der Entnahme weitere 60 s an Ort und Stelle gehalten, um eine langsame Diffusion dieser Lösung zu ermöglichen.
4. Für Studien über synergistische pharmakologische Wirkungen verabreichen Sie ein anderes Medikament durch systemische Methoden. In diesem Fall injizieren Sie das gewünschte Medikament oder die Kontrolle intrakraniell und verabreichen Sie unmittelbar danach ein zusätzliches Medikament intraperitoneal. Als Beispiel haben wir in dieser Studie die synergistischen analgetischen Wirkungen von Morphin und Ampakinen untersucht, um eine additive Wirkung zu testen. Wir infundierten intrakraniell ein AMPAkine in Kombination mit einer intraperitonealen Verabreichung von 1 mg/kg Morphin (eine sichere systemische Dosis).
   HINWEIS: Es wird empfohlen, zuerst intrakranielle Injektionen durchzuführen, da sie schwieriger durchzuführen sind als intraperitoneale Injektionen.

3. Analgesie-Assays und -Bewertung

1. Um die Wirkung intrakranieller Injektionen auf das akute Schmerzverhalten bei Ratten zu untersuchen, verwenden Sie den Plantartest (Hargreaves-Test), um die Entzugslatenz als Reaktion auf thermische Reize zu berechnen. Der Apparat der Hargreaves fokussiert einen Infrarotstrahl durch eine Glasfläche auf den Fuß der Ratte; Die Ratte steht und bewegt sich frei über der Glasfläche. Wenn Sie den Hargreaves-Test durchführen, fokussieren Sie den Infrarotstrahl unter dem Plantarbereich des Rattenfußes.
   1. Beginnen Sie mit der Durchführung von Hargreaves-Basistests vor der Injektion, um einen Ausgangswert für den Vergleich zu ermitteln.
2. Injizieren Sie keine Drogen jeglicher Art, bevor Sie einen Ausgangswert festgelegt haben. Führen Sie fünf gute Versuche im Abstand von 5 Minuten durch. Ein guter Versuch wird durch einen deutlichen Rückzug angezeigt, d.h. wenn die Ratte ihr Knie beugt und ihren Fuß nach oben und in den Körper hebt.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Versuche 5 Minuten voneinander entfernt sind, um eine Sensibilisierung der Ratte zu vermeiden. Das Hargreaves-Gerät zeichnet automatisch den Zeitpunkt der Entnahme auf, sobald der Infrarotstrahl unterbrochen wird. Achten Sie daher darauf, Versuche mit Fortbewegung, Gewichtsverlagerung usw. zu vernachlässigen. Wenn eine vergünstigte Testversion auftritt, warten Sie 5 Minuten und wiederholen Sie die Testversion.
3. Berechnen Sie die Entzugsschwellen, indem Sie den Durchschnitt der fünf Versuche nehmen.
4. Nachdem Sie einen Ausgangsdurchschnitt erhalten haben, beginnen Sie das Experiment, um die Entzugszeiten nach der Infusion von Arzneimitteln zu erhalten. Die Hargreaves-Tests können 20-30 Minuten nach intrakraniellen Injektionen durchgeführt werden, obwohl der genaue Zeitpunkt von der Pharmakokinetik der spezifischen Wirkstoffe abhängen kann. Damit soll sichergestellt werden, dass die Ratte das Medikament aufgenommen hat und seine Wirkung spürt. Führen Sie dieses Experiment auf die gleiche Weise wie Schritt 3.1 durch.
5. Berechnen Sie die Auszahlungsschwellen wie in Schritt 3.2 beschrieben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Sterotaktische Kanüle	PlasticsOne	8I26GA8MMKIT
Digitale Spritze	Hamilton	8440
AMPAkine	Sigma Aldrich	C-271
Dimethylsulfoxid	Sigma Aldrich	D4540
Hargreaves Apparatur	Ugo Basile	37370
Männliche Sprague-Dawley Ratten	Taconic Farms	NTac:SD
Sterile OP-Handschuhe	Dynarex	6535