$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Vorbereitung des Tieres auf die Operation
- Führen Sie chirurgische Eingriffe in einem sauberen, speziellen Raum durch. Autoklavieren Sie alle chirurgischen Instrumente und sterilisieren Sie sie vor der Operation mit einem Glasperlensterilisator.
HINWEIS: Verwenden Sie in diesem Protokoll FVB-Mäuse nach der Geburt Tag 10-12 (P10-12). Unterschiedliche Altersgruppen und Stämme von Mäusen können verwendet werden, um die Anforderungen eines bestimmten Projekts zu erfüllen. Mäuse, die älter als P40 sind, können eine Herausforderung darstellen, da der Bulla-Knochen härter wird. - Betäuben Sie die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion einer Mischung aus Ketaminhydrochlorid (100 mg/kg), Xylazinhydrochlorid (10 mg/kg) und Acepromazin (2 mg/kg). Beginnen Sie mit der chirurgischen Vorbereitung erst, wenn das Tier nicht mehr auf schmerzhafte Reize wie z. B. Zehenkneifen reagiert. Falls erforderlich, verabreichen Sie eine Auffrischungsdosis (ein Fünftel der ursprünglichen Dosis) des Anästhesiecocktails, um die ursprüngliche Anästhesieebene wiederherzustellen.
HINWEIS: Seien Sie bei diesem Schritt vorsichtig, da der größte Teil der in diesem Alter beobachteten Mortalität durch eine Überdosierung von Anästhetika verursacht wird. - Decken Sie die Augen des Tieres mit einer schützenden Augensalbe ab, um die Augen während der Narkose feucht zu halten und den Blinzelreflex des Tieres zu unterdrücken.
- Um eine Unterkühlung nach der Anästhesie zu vermeiden, positionieren Sie die Maus während des gesamten Eingriffs mit ausgestrecktem Hals auf einem Heizkissen, bis sie vollständig wach ist.
- Rasieren Sie den linken postaurikulären Bereich mit einem Haarschneider und desinfizieren Sie ihn vor der chirurgischen Manipulation mit 70% Ethanol und Povidon-Jod.
2. Der chirurgische Eingriff und die Vektorinjektion
- Verwenden Sie einen postaurikulären Zugang, um die Trommelfellbulla freizulegen. Schneiden Sie das Unterhautgewebe mit einer kleinen Schere ein, um den postaurikulären Muskel freizulegen. Nach dem Zurückziehen des Fettgewebes auf die hintere Seite des Schnitts trennen Sie die Muskeln auf der rechten und linken Seite senkrecht zum Schnitt, um das Schläfenbein freizulegen. Stellen Sie sicher, dass dieser Schnitt lang genug ist, um mit angemessener Visualisierung bequem zu arbeiten.
- Perforieren Sie die Paukenbulla mit einer 25-G-Nadel und erweitern Sie das Loch bei Bedarf mit einer Pinzette, indem Sie den Knochen zurückschälen, um den Zugang zur basalen Drehung der Cochlea zu ermöglichen, und erweitern Sie sich dann ausreichend, um die Steigbügelarterie und die Rundfenstermembran (RWM) sichtbar zu machen.
- Punktieren Sie das RWM vorsichtig in der Mitte mit einer Borosilikat-Kapillarpipette. Beobachten Sie an dieser Stelle den Flüssigkeitsausfluss durch das RWM. Das ist normal. Warten Sie, bis sich der Ausfluss stabilisiert hat (die ausgestoßene Flüssigkeit aus der Cochlea wird mit einem sterilen Filterpapier getrocknet).
HINWEIS: Achten Sie beim Halten und Vorschieben der Glasnadel darauf, dass die RWM-Perforation so gering wie möglich ist. Halten Sie die Pipetten je nach verwendetem Mikroskop mit einem Mikromanipulator oder mit der Hand mit einem Pipettenhalter. - Bereiten Sie die Pipetten mit einem Pipettenabzieher für die Injektion vor, so wie auch Patch-Clamp-Pipetten vorbereitet werden. Stellen Sie sicher, dass der Spitzendurchmesser groß ist (ca. 15 μm Durchmesser), damit das Ein- und Ausschleusen des Virus problemlos durchgeführt werden kann.
- 1 bis 2 μl Adeno-assoziierte Viren (AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP oder AAV2-GFP) werden in eine Injektionspipette aufgezogen. Nachdem sich der Ausfluss stabilisiert hat (5 bis 10 Minuten), injizieren Sie dieses fixierte Volumen durch das gleiche Loch, das zuvor in RWM gemacht wurde, in die Scala tympani.