In vivo Biolumineszenz-Bildgebung von humanen neuralen Vorläuferzellen in einem Mausgehirn

Zusammenfassung

Quelle: Weber, R. Z., et al., Intracerebral Transplantation and In Vivo Bioluminescence Tracking of Human Neural Progenitor Cells in the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (2022)

Dieses Video zeigt die Methode zur in vivo Biolumineszenz-Bildgebung von genetisch veränderten humanen neuralen Vorläuferzellen, die in ein Mausgehirn injiziert werden. Der Prozess umfasst die Injektion von Luciferin, die Vorbereitung der Bildgebung und den Nachweis von Biolumineszenzsignalen der transplantierten Zellen an der Injektionsstelle.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

In-vivo-Bildgebung

1. Aufbereitung von Luciferin
   1. Auftauen von D-Luciferin-Kaliumsalz bei Raumtemperatur (RT) und Herstellen einer frischen Stammlösung von D-Luciferin bei 30 mg/ml in PBS.
   2. Sterilisieren Sie die Stammlösung durch einen 0,22-μm-Spritzenvorsatzfilter.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die Arbeitslösung sofort zu verwenden. Bei Bedarf kann gelöstes Luciferin bei -20 °C gelagert werden. Eine längere Lagerung kann jedoch zu einer Verschlechterung des Signals führen. Luciferin ist ein lichtempfindliches Reagenz; Halten Sie es nach Möglichkeit von direktem Licht fern. Alternative Substrate, z. B. Cycluc, können ebenfalls in Betracht gezogen werden, um die Auflösungsgrenze zu verbessern.
2. Imaging
   1. Ersteinrichtung
      HINWEIS: Die Biolumineszenz-Bildgebung wurde mit einem In-vivo-Bildgebungssystem (siehe Materialtabelle) durchgeführt, das aus einer dunklen Kammer und einer gekühlten CCD-Kamera (Charge-Coupled Device) bestand.
      1. Doppelklicken Sie auf das Symbol der Living Image-Software und wählen Sie eine Benutzer-ID aus der Dropdown-Liste aus.
      2. Klicken Sie in der angezeigten Systemsteuerung auf Initialisieren. Sobald der Initialisierungsvorgang abgeschlossen ist, wird das Temperaturfeld in der Systemsteuerung grün.
      3. Aktivieren Sie in der Systemsteuerung die Kontrollkästchen "Lumineszierend" und "Fotografie" und wählen Sie "Automatische Belichtung (~60 s)". Wählen Sie ein Sichtfeld aus (für dieses Protokoll wurde D/12,5 cm gewählt). Geben Sie die Motivhöhe (1,5 cm) ein und wählen Sie die Option Motivhöhenfokus verwenden. Legen Sie die folgenden Parameter manuell fest: Large Binning, f/2, blockierter Anregungsfilter und offener Emissionsfilter.
   2. Bestimmen Sie die Injektionsmenge von D-Luciferin bei 300 mg/kg Körpergewicht.
      HINWEIS: Die empfohlene Standarddosis beträgt 150 mg/kg D-Luciferin. Dieses Verfahren wurde gemäß einem Protokoll angepasst, das eine höhere Sensitivität bei 300 mg/kg berichtete.
   3. Injizieren Sie das Luciferin intraperitoneal (i.p.).
      HINWEIS: Wenn das Tier vor der Injektion sediert werden muss, beachten Sie, dass dies die maximale Luziferase-Expressionszeit verlängern kann.
   4. Warten Sie 5 Minuten und betäuben Sie die Tiere dann mit einer kontinuierlichen Zufuhr von Isofluran (4,5 % in der Induktionsphase und 1,5-2 % in der Erhaltungsphase während des bildgebenden Verfahrens).
   5. Tragen Sie Augengleitgel auf die Augen auf und rasieren Sie dann die sedierten Tiere im Kopfbereich mit einem herkömmlichen Haarrasierer. Platzieren Sie die Tiere in der Bildgebungskammer und starten Sie die Bildgebung 15 Minuten nach der Luciferin-Injektion, indem Sie im Bedienfeld auf Erfassen klicken.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Verbrauchsmaterialien
Spritzenfilter; 0,22 μm	TPP	99722
Ausrüstung
Heizkissen			Produkt nach Wahl
In-Vivo-Bildgebungssystem (IVIS Lumina III mit Living Imaging 4.2 Softwarepaket)	Perkin Elmer	CLS136334
Isofluran-Verdampfer	Provet AG	330724
Pharmazeutika und Reagenzien
D-Luciferin Kaliumsalz	Perkin Elmer	122799
Ethanol; 70%			Produkt der Wahl
Isofluran (Isofluran (1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl-difluormethylether) 99,9%)	Provet AG	Alle Arzneimittel wurden von der Kantonsapotheke, Zürich, Schweiz
Ophtalmisches Gleitmittel (Retinolpalmitat: 15.000 IE)	Bausch & Lomb Swiss AG	Alle Arzneimittel wurden von der Kantonsapotheke Zürich, Schweiz, zur

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