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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Intrahippocampus-Zelltransplantation
HINWEIS: Alle Schritte in diesem Abschnitt werden außerhalb der Zellkulturhaube in der Tiereinrichtung durchgeführt. Die frühe postnatale Transplantation von Zellen in das Gehirn wurde an P2 durchgeführt, wobei P0 am Tag der Geburt berücksichtigt wurde.
- Bereiten Sie sich auf das Transplantationsexperiment vor, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Autoklavieren Sie das gesamte chirurgische Material oder, falls dies nicht möglich ist, sterilisieren Sie es mit einer anderen zugelassenen Methode.
- Montieren Sie die Injektionsspritze ohne Glaskapillare in den Halter. Spülen Sie die Nadel mit Wasser aus.
HINWEIS: Die Nadel muss 33 G wiegen. - Krümmen Sie die Spitze einer 30-G-Insulinnadel um 90°.
- Erstellen Sie eine selbstgemachte Play-Doh-ähnliche Bühne, um den Welpen mit flachem Kopf zu positionieren (Abbildung 1A).
- Holen Sie den Mäusekäfig mit der Mutter und den Welpen, bevor Sie etwas für die Operation vorbereiten, damit sie sich an die neue Umgebung gewöhnen können.
- Bereiten Sie ein Tablett mit nassem Eis und einen leeren Käfig mit etwas Papier für das Isofluran vor.
- Betäuben Sie das Mäusewelpen.
- Tränken Sie ein Blatt Papier mit Isofluran (siehe Materialtabelle) und legen Sie es in den leeren Käfig. Nehmen Sie vorsichtig einen Welpen und setzen Sie ihn mit dem mit Isofluran getränkten Papier in den Käfig.
HINWEIS: Lassen Sie niemals weniger als drei Welpen bei der Mutter. Überschreiten Sie nicht 20-30 s Isofluran-Anästhesie, sonst kann der Welpe sterben. - Überprüfen Sie die Wirkung der Anästhesie durch Bewegungsstopp.
- Legen Sie den Welpen unmittelbar nach der Anästhesie auf ein feuchtes Tuch auf der Oberfläche des nassen Eises. Halten Sie das Tier 3 Minuten lang auf Eis, bis die oberen Gliedmaßen weißlich werden (Abbildung 1B, blauer Pfeil). Dies dauert in der Regel 2-3 Minuten.
- Nutzen Sie diese Zeit, um die Spritze mit der Zellsuspension zu befüllen. Resuspendieren Sie die Zellen vorher vorsichtig mit einer Pipette.
- Platzieren Sie den Welpen auf dem stereotaktischen Rahmen. Verwenden Sie die Ohrbügel in die entgegengesetzte Richtung (Abbildung 1A, magentafarbene Pfeile).
HINWEIS: Die Rückseite der Ohrbügel ist weniger spitz, und da P2-Welpen keine Ohren haben, verwenden Sie die flachere Seite, um Verletzungen des Tieres zu vermeiden. - Prüfen Sie von der Seite, ob der Kopf gerade ist. Der Kopf muss flach sein; Verwenden Sie die Play-Doh-ähnliche Phase, um sich darauf einzustellen.
HINWEIS: Welpen in diesem Alter haben ihre Augen noch nicht geöffnet, daher müssen diesbezüglich keine zusätzlichen Schritte unternommen werden. Welpen haben in diesem Alter noch kein Fell, daher ist keine Rasur des Bereichs erforderlich. Es wird keine spezifische Schmerzbehandlung durchgeführt, da es sich nicht um einen offenen Hautschnitt handelt und keine Nähte erforderlich sind. - Bewahren Sie den Welpen während der gesamten Dauer der Operation auf Eis (auf Seidenpapier) auf.
HINWEIS: Bringen Sie das Eis nicht in direkten Kontakt mit der Haut des Welpen.
- Führen Sie die Injektion durch.
- Reinigen Sie die Hautoberfläche mit einem weichen Tuch, das in Ethanol getränkt ist.
- Identifizieren Sie Lambda und setzen Sie die Koordinaten auf der digitalen Anzeigekonsole des stereotaktischen Instruments auf Null (Abbildung 1C, gelbe gestrichelte Linie). Sagittale und lambdoide Nähte sind für das Auge leicht sichtbar, da sie als rote Linien vaskularisiert sind.
HINWEIS: Wenn Sie Schwierigkeiten haben, Lambda zu visualisieren, legen Sie ein kleines Stück Eis auf die Haut und warten Sie ein paar Minuten, bis es abgekühlt ist. Entfernen Sie dann das Stück Eis, und die subtile Aufhellung der Haut ermöglicht es Ihnen, zu visualisieren. - Positionieren Sie die Injektionsnadel auf die gewünschten Koordinaten. Im beschriebenen Protokoll war die Zielregion der Hippocampus, und die Koordinaten waren wie folgt: anterior-posterior (AP) +0,85 und medio-lateral (ML) +1,35.
- Verwenden Sie eine um 90° gebogene Insulinnadel, um in den Schädel einzudringen und ein winziges Loch zu erzeugen.
- Bringen Sie die Injektionsnadel nach unten, bis sie den Schädel durchquert hat, und stellen Sie die dorso-ventralen (DV) Koordinaten auf Null. Senken Sie die Nadel ab, bis die gewünschte DV-Koordinaten erreicht sind. Im beschriebenen Protokoll waren die Koordinaten DV −1,1.
- Injizieren Sie gemäß den vorgegebenen Zeitintervallen.
HINWEIS: Im beschriebenen Protokoll waren die genauen Zeiten wie folgt: (i) nach dem Heruntergehen auf die DV-Koordinate 3 Minuten warten, (ii) 1 μl Volumen für 5 Minuten injizieren und (iii) nachdem das gesamte Volumen injiziert wurde, 3 Minuten warten. - Ziehen Sie die Nadel langsam zurück.
- Beenden Sie den Vorgang.
HINWEIS: Die Operation darf nicht länger als 15 Minuten dauern, um das Überleben des Welpen zu sichern und Schäden durch die Anästhesie durch Unterkühlung zu vermeiden. - Wärmen Sie den Welpen mit den Händen auf, bis er sich zu bewegen beginnt, bevor Sie ihn der Mutter zurückgeben.
- DOX in einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,5%iger Saccharoselösung mindestens 2 Tage vor und 3 Wochen nach der Transplantation (PT) als Trinkwasser verabreichen, um die Zelldifferenzierung in vivo fortzusetzen.
