Agarose-eingebetteter Elektroporations-unterstützter Gentransfer in kortikalen Interneuronen-Vorläuferzellen der Maus

1. Fokale DNA-Injektionen
   1. Bereiten Sie eine Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Mischung aus Expressionsvektoren vor: pCAGGs-IRES-GFP (Kontrollvektor) + pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, in einer Konzentration von 1 μg/μL für jeden Vektor. Fügen Sie schnelle grüne Lösung (Stamm 25 mg/ml) in einer Verdünnung von 1/10 hinzu.
   2. Füllen Sie eine gezogene Glasmikropipette (0,5 mm Innendurchmesser und 1 mm Außendurchmesser) mit 10 μL des DNA-Gemischs und injizieren Sie kleine Mengen (im Bereich von 25-50 nL) in die ausgewählte Region (Mediale ganglionäre Eminenz oder MGE/kaudales Ganglionär oder CGE) der Scheibe (Abbildung 1 und Abbildung 2).
2. Akute Elektroporation
   HINWEIS: Die Elektroporation sollte unmittelbar nach der fokalen DNA-Injektion durchgeführt werden.
   1. Platzieren Sie den kleinen Agaroseblock auf der Petrischalenelektrode und befestigen Sie die Agarosesäule mit einem flachen Mikrospatel an der mobilen Abdeckelektrode.
   2. Übertragen Sie die Scheibe mit ihrer Stützmembran auf den Agaroseblock und platzieren Sie die obere Elektrode mit der Agarosesäule auf der ausgewählten Region (MGE/CGE) der Scheibe.
      HINWEIS: Ladespannungen von 125 V (zwei Impulse à 5 ms, Intervall 500 ms) führen zu einer erfolgreichen Elektroporation (Abbildung 3).
3. Legen Sie nach der Elektroporation die Scheibe mit ihrer Stützmembran in die Schale und überführen Sie sie in einen CO₂ -Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C.

Abbildung 1: Repräsentative telencephale Schnitte, die für akute Elektroporationsexperimente verwendet wurden. (A-C) Telenzephale Schnitte wurden in drei verschiedenen sequentiellen rostrocaudalen Niveaus erhalten, gefärbt mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI). LGE: Eminenz der lateralen Ganglion; MGE: mediale ganglionäre Eminenz; CGE: kaudale ganglionäre Eminenz. Maßstabsleisten = 200 μm. Die gelben Sternchen zeigen die Elektroporationsstelle in jeder Scheibe an. Die weiße Linie markiert den Rand der ganglionären Eminenz.

Abbildung 2: Schematische Darstellung des experimentellen Arbeitsablaufs. (A) Schnitte aus dem Gehirn von Mäusen werden mit geeigneten Konstrukten elektroporiert, und (B) nach 12 h werden modifizierte kortikale Interneuronen (CI)-Vorläufer isoliert und (C) in das Pallium von neugeborenen Mausbabys transplantiert (P0-P2). Um die Aktivität unreifer CIs zu modifizieren, wurde P14-Welpen, die eine Zelltransplantation erhalten hatten, gemäß dem vorgestellten Protokoll vier konstitutive Tage lang CNO oder Vehikel injiziert. (A') Foto der Elektroporation eines akuten Maushirnschnitts.

Abbildung 3: Repräsentatives erfolgreiches Experiment zur akuten Scheiben-Elektroporation. (A) Repräsentativer koronaler Schnitt aus einem E14.5-Embryohirn, der in der CGE mit den beiden Plasmiden pCAGGs-IRES-GFP (grün fluoreszierendes Protein) und pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP (Rot fluoreszierendes Protein) transfiziert und für 12 h kultiviert wurde. Der Schnitt wurde immungefärbt für GFP (A, B, C) und RFP (A, B, D). Der eingerahmte Bereich in Feld A ist vergrößert, um nur die Expression von Fluoreszenzreportern (B), GFP (C) und RFP (D) anzuzeigen. Die weiße Linie markiert den Rand der ganglionären Eminenz. B-D: dasselbe Foto, verschiedene Kanäle oder eine Kombination aus zwei verschiedenen Kanälen. Maßstabsleisten = 200 μm (A), 100 μm (B-D).