Agarose-eingebetteter Elektroporations-unterstützter Gentransfer in kortikalen Interneuronen-Vorläuferzellen der Maus

Zusammenfassung

Quelle: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Injektion eines Plasmidvektors, der das interessierende Gen trägt, in Interneuron-Vorläuferzellen in einem embryonalen Hirnschnitt, gefolgt von einer Elektroporation für den Plasmideintritt und die Genexpression. Diese modifizierten Vorläuferzellen können später zur Behandlung von Hirnerkrankungen eingesetzt werden.

Protokoll

1. Fokale DNA-Injektionen
   1. Bereiten Sie eine Desoxyribonukleinsäure (DNA)-Mischung aus Expressionsvektoren vor: pCAGGs-IRES-GFP (Kontrollvektor) + pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, in einer Konzentration von 1 μg/μL für jeden Vektor. Fügen Sie schnelle grüne Lösung (Stamm 25 mg/ml) in einer Verdünnung von 1/10 hinzu.
   2. Füllen Sie eine gezogene Glasmikropipette (0,5 mm Innendurchmesser und 1 mm Außendurchmesser) mit 10 μL des DNA-Gemischs und injizieren Sie kleine Mengen (im Bereich von 25-50 nL) in die ausgewählte Region (Mediale ganglionäre Eminenz oder MGE/kaudales Ganglionär oder CGE) der Scheibe (Abbildung 1 und Abbildung 2).
2. Akute Elektroporation
   HINWEIS: Die Elektroporation sollte unmittelbar nach der fokalen DNA-Injektion durchgeführt werden.
   1. Platzieren Sie den kleinen Agaroseblock auf der Petrischalenelektrode und befestigen Sie die Agarosesäule mit einem flachen Mikrospatel an der mobilen Abdeckelektrode.
   2. Übertragen Sie die Scheibe mit ihrer Stützmembran auf den Agaroseblock und platzieren Sie die obere Elektrode mit der Agarosesäule auf der ausgewählten Region (MGE/CGE) der Scheibe.
      HINWEIS: Ladespannungen von 125 V (zwei Impulse à 5 ms, Intervall 500 ms) führen zu einer erfolgreichen Elektroporation (Abbildung 3).
3. Legen Sie nach der Elektroporation die Scheibe mit ihrer Stützmembran in die Schale und überführen Sie sie in einen CO₂ -Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C.

Ergebnisse

Abbildung 1: Repräsentative telencephale Schnitte, die für akute Elektroporationsexperimente verwendet wurden. (A-C) Telenzephale Schnitte wurden in drei verschiedenen sequentiellen rostrocaudalen Niveaus erhalten, gefärbt mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAP...

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