Injektion rekombinanter adeno-assoziierter Vektoren in einem Mausmodell für spinale und bulbäre Muskelatrophie

Zusammenfassung

Quelle:
Pourshafie, N., et al. Systemische Verabreichung von microRNA unter Verwendung des rekombinanten Adeno-assoziierten Virus Serotyp 9 zur Behandlung neuromuskulärer Erkrankungen bei Nagetieren. J. Vis. Exp. (2018).

In diesem Video wird eine von spinaler und bulbärer Muskelatrophie oder SBMA betroffene Maus einer Schwanzveneninjektion von rekombinanten AAV-Vektoren (Adeno-assoziierten Vektoren) unterzogen, die ein Plasmid tragen, das für therapeutische microRNA kodiert. Der Vektor produziert microRNA, die an mutierte AR (Androgenrezeptor)-mRNA (Boten-Ribonukleinsäure) bindet und deren Abbau auslöst. Dies reduziert die Ansammlung toxischer Proteine und trägt zur Verbesserung der neuromuskulären Funktion bei.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Schwanzvenen-Injektion von AAV-miRNA-Plasmid

HINWEIS: Dieser Schritt muss entsprechend dem Zielgen sowie dem Alter und Gewicht der Mäuse angepasst werden. Verwenden Sie die Richtlinien des Institutional and Animal Care and Use Committee (IACUC), um den Dosisbereich, das Volumen und den besten Verabreichungsweg basierend auf dem Alter und Gewicht der Mäuse zu bestimmen. Es wird erwartet, dass das GFP-Fluoreszenzsignal (grün fluoreszierendes Protein) und die miRNA-Expressionswerte im Zielgewebe ab 2 Wochen nach der Injektion ihren Höhepunkt erreichen. Das folgende Protokoll bezieht sich auf männliche Mäuse im frühen Erwachsenenalter. AAV sollte gemäß den Richtlinien der Biosicherheitsstufe 1 als biologische Gefahr behandelt werden.

1. Teilen Sie den AAV-miRNA-Plasmidbestand in 100-200 μl Aliquote mit einer Viruslast von 10^{10-10 11} Virusgenomen pro ml (vg/ml) unter Verwendung von steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Für den Umgang mit der AAV-Lösung sollte persönliche Schutzausrüstung für biologische Gefahren im Labor verwendet werden.
   HINWEIS: Sobald ein Aliquot aufgetaut ist, kann es bis zu zwei Wochen lang bei 4 °C gelagert werden. Virusbestände können im -80 °C Gefrierschrank gelagert werden.
2. Halten Sie die Maus in handelsüblichen Fixierungen wie Plastik- oder konischen Kunststofffolienschläuchen der richtigen Größe fest.
3. Reinigen Sie die Oberfläche des Schwanzes mit Tüchern mit 70 % Alkohol.
4. Halten Sie ein warmes Pad (28-30 °C) 30 Sekunden lang unter den Schwanz, um die Vasodilatation zu erhöhen. Alternativ können Sie die Tiere mit einer roten Wärmelampe (in einem Abstand von 2-3 Fuß) erwärmen oder den Schwanz in warmes Wasser tauchen.
5. Beginnend mit dem distalen Teil des Schwanzes führen Sie die mit dem viralen Aliquot beladene Nadel (27-30 G) in einem Winkel von 15° vom Schwanz nach oben in die Vene ein. Stellen Sie vor der Injektion sicher, dass die Nadel richtig eingeführt ist.
   1. Wenn während der Injektion ein Widerstand zu spüren ist oder Schwellungen unter der Haut auftreten, stoppe die Prozedur. Entfernen Sie die Nadel und führen Sie sie oberhalb der vorherigen Injektionsstelle wieder ein.
      HINWEIS: Alternativ kann dies durch sanftes Aspirieren der Nadel und Beobachten von Blut erreicht werden. Eine starke Aspiration kann die Schwanzvene kollabieren lassen. Wenn die Vene während der Injektion blanchiert, wird die Nadel korrekt eingeführt.
6. Warten Sie nach Abschluss der Injektion einige Sekunden, bevor Sie die Nadel anheben.
7. Beobachten Sie die Injektionsstelle auf Blutungen. Üben Sie mit zwei Fingern mäßigen Druck auf die Stelle aus, bis die Blutung aufhört.
8. Bringen Sie das Tier in seinen Käfig zurück.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Scale	Pelouze	SP5
Nalgene Eimer	Thermo Scientific	12014000	4000 mL
Mikrozentrifugenröhrchen	USA Scientific	1615-5500
Laktat-Ringer's Solution	Baxter Healthcare	0338-0114-04
Mini-Vortexer	Fisher Scientific	128101
Zentrifuge	Eppendorf	22624415
Laborfilm	Bemis	PM996
1-mL-Spritze	BD	309626	Wird mit einer 25-g-Nadel geliefert. Ersetzen durch 27-30 g Injektionsnadel
30 g Nadel	BD	305106
Isofluran	Piramal Healthcare	66794-013-25	Isofluran USP 250 mL
Anästhesiemaske	Kopf Instruments	906
Gauze	Henry Schein	100-2524	2" x 2" (5cm x 5cm)
Pipettenspitzen	USA Scientific	1111-0816
Micropipet	Gilson	4642080
Gasanästhesie-Vaporizer	SurgiVet	4214322	Classic T3
Gas-Anästhesie-Sauger	SurgiVet	32373B10	Enviro-PURE
Heizkissen	Sears	17280
Bankpad	VWR	56617-006
Rotarod	Panlab/ Harvard Apparatus	76-0772	4 Ratten/ 4 Mäuse
70% Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	2401	140 Proof
70% Isopropanol	VWR	89108-160