Intrakranielle Injektion von mikrobiellen Metaboliten aus dem Darm in einem Mausmodell

Zusammenfassung

Quelle: Liou, C. et al. Intrazerebroventrikuläre Verabreichung von mikrobiellen Metaboliten aus dem Darm bei frei beweglichen Mäusen. J. Vis. Exp. (2022).

Dieses Video zeigt die intrakranielle Injektion von kurzkettigen Fettsäuren (SCFAs) in eine frei bewegliche Maus, um deren Auswirkungen auf das hirnvermittelte Verhalten zu untersuchen. Eine Injektorkanüle wird in eine Führungskanüle eingeführt, die in das Gehirn der Maus implantiert wird. Nach der Genesung akklimatisiert sich die Maus in einem neuartigen Käfig. Anschließend werden SCFAs verabreicht und das Bewegungsverhalten aufgezeichnet.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Vorbereitung für das Versuchstier

1. : Besorgen Sie sich 6-8 Wochen alte männliche Wildtyp-Mäuse vom Typ C57BL/6JNarl von einem Händler.
2. Halten Sie die Mäuse in einem Standard-Mauskäfig mit Standard-Mauskäfig und sterilisiertem Wasser ad libitum.
   HINWEIS: Die Haltungsbedingungen für das Versuchstierzentrum betragen 22 ± 1 °C Temperatur, 55 % ± 10 % Luftfeuchtigkeit und ein 13 h/11 h Hell-Dunkel-Zyklus.

2. Stereotaktische Chirurgie

1. Bereiten Sie das stereotaktische Instrument, die chirurgischen Instrumente und die zugehörigen Gegenstände vor und sterilisieren Sie sie.
   HINWEIS: Alle Gegenstände, die direkt mit der Operationsstelle in Berührung kommen, sollten sterilisiert werden, um Infektionen zu vermeiden.
2. Betäuben Sie die Maus, indem Sie sie in den Plexiglaskäfig mit 1 % bis 5 % Isofluran Sauerstoff legen.
   HINWEIS: Beobachten Sie die Maus genau, um sicherzustellen, dass die Atemfrequenz bei etwa einem Atemzug pro Sekunde gehalten wird.
3. Nehmen Sie die Maus aus der Anästhesiekammer. Rasieren Sie die Operationsstelle (Mauskopf) mit einem Haustiertrimmer. Platzieren Sie die Maus auf dem stereotaktischen Rahmen, indem Sie die Mausschneidezähne an der Schneidezahnstange im stereotaktischen Schneidezahnhalter fixieren. Bedecken Sie die Nase mit der Nasenkonusmaske.
4. Betäuben Sie die Maus während der gesamten stereotaktischen Operation mit 1%-2,5% Isofluran in Sauerstoff. Bewerten Sie die Nozizeption der Maus über den Zehenkneifreflex und sorgen Sie für eine konstante Atemfrequenz, bevor Sie die Operationsstelle einschneiden.
5. Platzieren Sie ein Heizkissen (37,0 °C) unter der Maus auf dem stereotaktischen Rahmen, um die Körpertemperatur während der Operation zu halten. Alternativ können Sie die Kerntemperatur mit Hilfe einer rektalen Wärmesonde halten, die den programmierten Wärmer und das Heizkissen verbindet.
6. Entfernen Sie das abgeschnittene Fell am Kopf mit Klebeband. Injizieren Sie der Maus das Analgetikum Ketoprofen (5 mg/kg) subkutan, um die Schmerzen zu lindern. Tragen Sie Augensalbe auf, um trockene Augen zu vermeiden.
7. Führen Sie den spitzen Ohrbügel in den Gehörgang ein, um den Kopf zu fixieren.
8. Zentrieren Sie den Kopf, indem Sie die Skala der Ohrstange anpassen.
9. Ziehen Sie die Nasenklemme am Schneidezahnhalter fest, um vertikale Bewegungen zu vermeiden. Drücken Sie leicht auf den Kopf, um zu überprüfen, ob der Kopf fixiert ist, und um zu vermeiden, dass sich der Kopf bei nachfolgenden Operationen lockert.
10. Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit drei abwechselnden Peelings mit Chlorhexidin mit einem Wattestäbchen. Beginnen Sie jedes Peeling von der Mitte zur Außenseite (vom am meisten desinfizierten zentralen Bereich bis zum am wenigsten desinfizierten Bereich).
    HINWEIS: Die Verwendung von Peelings von der Mitte nach außen könnte Wissenschaftlern helfen, Infektionen und Kontaminationen durch das Fell zu minimieren. Der äußere Bereich befindet sich in der Nähe der unrasierten Kopfregion, die noch viel Fell aufweist und nicht einfach gründlich zu desinfizieren ist.
11. Die Kopfhaut mit einer chirurgischen Klinge vorne/hinten (<1 cm) einschneiden. Öffnen Sie den Schnitt und wischen Sie den Schädel mit einem Wattestäbchen ab, das von einer Mikrodisparezange gehalten wird.
    HINWEIS: Die Mikrodisparierzange, die chirurgische Klinge und die Wattestäbchen müssen vor der Operation durch Autoklavieren sterilisiert werden. Während des chirurgischen Eingriffs ist das gesamte chirurgische Gerät mit einem Glasperlensterilisator (150 °C) mindestens 5 s vor und nach jedem Tier zu sterilisieren. Bereiten Sie ein sterilisiertes Becherglas vor, um die chirurgische Klinge und die Pinzette während des chirurgischen Prozesses und zwischen den Tieren zu halten.
12. Identifiziere das Bregma und Lambda auf dem Schädel. Verwenden Sie das Bregma als Referenz, um den interessierenden Bereich zu lokalisieren.
    1. Optional: Montieren Sie den stereotaktischen Bohrer auf dem stereotaktischen Bohrerhalter und verwenden Sie die Spitze des Bohrers, um Bregma als Referenz anzuführen. Sterilisieren Sie den stereotaktischen Bohrer mit dem Glasperlensterilisator (150 °C) für mindestens 5 s.
13. Kalibrieren und richten Sie die horizontale Ebene des flachen Schädels in der linken/rechten und vorderen/hinteren Ebene mit Bregma/Lambda aus.
    HINWEIS: Wenn sich die Maus nicht in einer korrekten horizontalen Ebene befindet, montieren Sie die Maus wieder auf dem stereotaktischen Instrument.

3. Kommerzielle kundenspezifische Kanülenimplantation

1. Identifizieren und beschriften Sie die Position des rechten Seitenventrikels anhand der stereotaktischen Koordinaten: Abstand zum Bregma, anterior/posterior (A/P): 0,26 mm, medial/lateral (M/L): -1,0 mm, dorsal/ventral (D/V): -2,0 mm.
   HINWEIS: Die Koordinaten können je nach interessierendem Bereich geändert werden. Die Koordinaten für den lateralen Ventrikel basieren auf adulten C57BL/6J-Mäusen mit einem Gewichtsbereich von 26-30 g.
2. Bohren Sie mit einem stereotaktischen Bohrer ein Loch (Durchmesser = 1,5 mm) durch den Schädel an der markierten Stelle für die Implantation einer handelsüblichen Führungskanüle.
3. Bohren Sie zwei bis vier weitere Löcher (Durchmesser = 1,5 mm) in den Schädel mit einem stereotaktischen Bohrer zur Befestigung von Edelstahlschrauben.
   HINWEIS: Sterilisieren Sie den stereotaktischen Bohrer mit einem Glasperlensterilisator (150 °C) mindestens 5 s vor und nach jedem Tier.
4. Wischen Sie die Knochenreste ab und stoppen Sie die Blutung mit einem Wattestäbchen.
5. Wischen Sie den Schädel mit Lidocain (1 mg/kg) mit einem Wattestäbchen ab, um eine lokalanästhetische, juckreizstillende und schmerzlindernde Wirkung zu erzielen. Wenn die Blutung nach dem Bohren nicht aufhört, legen Sie ein Wattestäbchen vorsichtig auf das Loch zur Blutstillung.
6. Montieren Sie zwei bis vier Edelstahlschrauben an den Löchern, um Dübel für Dentalacryl bereitzustellen.
7. Setzen Sie die handelsübliche Führungskanüle auf den stereotaktischen Kanülenhalter und desinfizieren Sie sie mit dem Glasperlensterilisator (150 °C).
   HINWEIS: Die handelsübliche Führungskanüle, der handelsübliche Dummy und der kommerzielle Injektor (Abbildung 1A) wurden gemäß den in der Materialtabelle angegebenen Spezifikationen angepasst.
8. Bewegen Sie den stereotaktischen Kanülenhalter in das Loch, das für den lateralen Ventrikel gebohrt wurde, und führen Sie die kommerzielle Führungskanüle langsam bis zur gewünschten Tiefe (2,5 mm) in das Loch ein.
   HINWEIS: Die dorsale/ventrale Koordinate kann definiert werden, indem die Spitze der kommerziellen Führungskanüle als Referenz eingestellt wird, wenn die Spitze kaum in das Loch eingeführt wird.
9. Tragen Sie 10 μl n-Butylcyanacrylat-Klebstoff (Gewebekleber) auf, um die handelsübliche Führungskanüle in der Bohrung zu fixieren und warten Sie 3-4 min. Lösen Sie die handelsübliche Führungskanüle vorsichtig aus dem stereotaktischen Kanülenhalter und bewegen Sie den Halter weg.
10. Tragen Sie das Zahnacryl auf die eingeschnittene Kopfhaut auf, um die kommerzielle Führungskanüle zu fixieren, und warten Sie mindestens 5 Minuten. Implantieren Sie den handelsüblichen Schnuller in die kommerzielle Führungskanüle, um eine Verstopfung der Kanüle durch Blut oder Körperflüssigkeit zu vermeiden (Abbildung 1B).
11. Lösen Sie die Ohrstange aus dem Gehörgang und entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen.
12. Setzen Sie die Maus in einen neuen Käfig mit einem Heizkissen darunter, um sich von der Narkose zu erholen, und beobachten Sie sie kontinuierlich, bis die Maus vollständig erwacht ist.
    HINWEIS: Lassen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es wieder ausreichend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu erhalten. Ein Tier, das sich einer Operation unterzogen hat, sollte nicht in die Gesellschaft anderer Tiere zurückkehren, bis es sich vollständig erholt hat.
13. Bringen Sie die Maus in eine Einzel- oder Gruppenhaltung zurück, abhängig vom Protokoll des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) und dem Versuchsdesign. Achten Sie bei der Gruppenhaltung darauf, dass weniger Mäuse in einem Käfig untergebracht werden, um unerwünschte Verletzungen oder das Ablösen der Kanüle zu minimieren.
14. Verabreichen Sie Ibuprofen (0,2 mg/ml) im Trinkwasser für mindestens 3 Tage zur postoperativen Versorgung und überwachen Sie mindestens 3 Tage lang zweimal täglich auf Anzeichen von Schmerzen und Beschwerden.
    1. Tragen Sie während der postoperativen Pflege Roxithromycin-Salbe auf die Haut auf, um Entzündungen und Infektionen bei den Mäusen zu verhindern.
    2. Überwachen Sie weiterhin den Zustand des Tieres und injizieren Sie rechtzeitig intraperitoneal 5 % Glukose und/oder 0,9 % Natriumchlorid, um genügend Energie bereitzustellen.
    3. Wenn sich der Zustand von Schmerzen, Stress oder Infektion stetig verschlechtert, euthanasieren Sie die Maus durch Einatmen von CO₂.
15. Warten Sie 1 Woche nach der Operation, bis die Maus für die intrazerebroventrikuläre Verabreichung von kurzkettigen Fettsäuren (SCFAs) und Verhaltenstests bereit ist.

4. Herstellung von SCFAs

1. Natriumacetat, Natriumbutyrat und Natriumpropionat in künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) auflösen (siehe Materialtabelle).
2. Stellen Sie sicher, dass die Chemikalien vollständig aufgelöst sind, stellen Sie dann den pH-Wert auf 7,4 ein und filtrieren Sie das SCFAs-Gemisch zur Sterilisation durch einen 0,22-μm-Filter.

5. Richten Sie das Infusionssystem für die intrazerebroventrikuläre Verabreichung von SCFAs während des Verhaltenstests

1. ein. Montieren Sie eine Deckenkamera, um das Verhalten aufzuzeichnen. Verbinden Sie die Kamera mit einem Computer, um die Videoaufzeichnungssoftware zu steuern (Abbildung 2).
2. Füllen Sie eine 10-μl-Spritze mit destilliertem Wasser.
   HINWEIS: Vermeiden Sie Luftblasen in der Mikroliterspritze.
3. Verbinden Sie eine Mikroinjektionspumpe mit dem Mikroinjektionscontroller.
4. Montieren Sie die Mikroliterspritze an der Mikroinjektionspumpe. Um die Spritze einzusetzen, drücken Sie den Knopf, um die Klemme zu lösen, und setzen Sie die Spritze in die entsprechende Position ein. Schließen Sie die Klemme und ziehen Sie die Kolbenhalteschraube an der Mikroinjektionspumpe fest (Abbildung 3A).
5. Setzen Sie den handelsüblichen Injektor in das Polyethylenrohr ein (Abbildung 1A).
6. Hängen Sie den Polyethylenschlauch an die Deckenkamera über der Testarena.
7. Füllen Sie das Polyethylenröhrchen mit destilliertem Wasser und verwenden Sie eine Insulinspritze. Verbinden Sie die Mikroliterspritze mit dem hängenden Polyethylenröhrchen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Polyethylenschlauch lang genug ist, damit sich die Maus frei im Testbereich bewegen kann.

6. Systemeinstellungen des Mikroinjektions-Controllers

1. Schalten Sie den Mikroinjektions-Controller ein, und drücken Sie Display All Channels, um auf den Befehlsbildschirm zuzugreifen (Abbildung 3C). Drücken Sie auf Konfiguration und stellen Sie das Volumenziel auf 9.800 nL und die Förderrate auf 100 nL/s ein. Ziehen Sie 9.800 nL destilliertes Wasser aus dem Polyethylenröhrchen, das mit der Mikroliterspritze verbunden ist (drücken Sie die Richtung, um in den Infusionsmodus zu wechseln, und drücken Sie RUN) (siehe rote Quadrate auf dem Befehlsbildschirm in Abbildung 3C).
2. Drücken Sie Configuration und stellen Sie das Volumenziel auf 3.000 nL und die Fördermenge auf 100 nL/s ein. Entnehmen Sie 3.000 nL Mineralöl (drücken Sie die Richtung, um in den Entnahmemodus zu wechseln, und drücken Sie RUN) (siehe rote Quadrate auf dem Befehlsbildschirm in Abbildung 3C).
   HINWEIS: Am Polyethylenrohr sollte eine klare Öl-Wasser-Phasentrennung beobachtet werden.
3. Demontieren Sie das Polyethylen-Röhrchen von der Mikroliter-Spritzennadel. Spucken Sie 3.000 nL destilliertes Wasser aus der Mikroliter-Spritzennadel aus (drücken Sie Direction, um in den Infusionsmodus zu wechseln, und drücken Sie RUN).
4. Führen Sie die Mikroliterspritze wieder in das Polyethylenröhrchen ein. Drücken Sie auf Konfiguration und stellen Sie das Volumenziel auf 9.500 nL mit einer Förderrate von 100 nL/s ein. Entnahme von 9.500 nL SCFAs (drücken Sie Direction, um in den Entnahmemodus zu wechseln, und drücken Sie RUN). Beschriften Sie die Öl-SCFAs-Phase, um zu überprüfen, ob die SCFAs erfolgreich infundiert wurden.
5. Drücken Sie Configuration und stellen Sie das gewünschte Volumenziel mit einer Förderrate von 7 nL/s ein. Drücken Sie Direction, um in den Infusionsmodus zu wechseln (siehe rote Quadrate auf dem Befehlsbildschirm in Abbildung 3C).
   HINWEIS: Bestimmen Sie das Volumen basierend auf der Infusionszeit. Wenn die Infusionszeit beispielsweise 3 Minuten für die Verabreichungsrate von 7 nL/s beträgt, ist das Zielvolumen = 1.260 nL.
6. Drücken Sie RUN, um die Mikroliterspritze nach vorne zu infundieren, bis die Flüssigkeit am vorderen Ende des kommerziellen Injektors austritt, bevor Sie den Injektor in die Kanüle für die SCFA-Injektion einführen.

7. Infusion von SCFAs in den Seitenventrikel durch die kommerzielle Führungskanüle bei einer frei beweglichen Maus

1. Betäuben Sie die Maus, indem Sie sie in den Plexiglaskäfig mit 1 % bis 5 % Isofluran in Sauerstoff legen.
   HINWEIS: Beobachten Sie die Maus genau, um sicherzustellen, dass die Atemfrequenz bei etwa einem Atemzug pro Sekunde gehalten wird.
2. Verzerren Sie die Maus und führen Sie den handelsüblichen Injektor in die handelsübliche Führungskanüle ein (Abbildung 3B).
   HINWEIS: Wenn die handelsübliche Führungskanüle durch Blut oder Körperflüssigkeit verstopft ist, befreien Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette.
3. Lassen Sie die Maus sich 15 Minuten lang in einem Käfig von der Narkose erholen, bevor Sie den Verhaltenstest durchführen.
4. Platzieren Sie die Maus für den grundlegenden Fortbewegungstest in einem neuartigen Käfig und lassen Sie sie 35 Minuten lang frei erkunden. Infundieren Sie SCFAs mit einer Förderrate von 7 nL/s für ein Zielvolumen von 2.100 nL in den ersten 5 Minuten (drücken Sie die Richtung, um in den Infusionsmodus zu gelangen, und drücken Sie RUN).
   HINWEIS: Die Fortbewegung im neuartigen Käfig kann mit einer Video-Tracking-Software für das Tierverhalten analysiert werden.
5. Betäuben Sie die Maus (Wiederholung von Schritt 7.1) und entfernen Sie den kommerziellen Injektor aus der kommerziellen Führungskanüle.
   HINWEIS: Der Maus können wiederholt verschiedene Kontrollen/Metaboliten injiziert werden, nachdem die vorherige Injektion so lange wie möglich ausgewaschen wurde. Solange die Kanüle auf dem Kopf der Maus fixiert ist, kann die Maus immer wieder mit verschiedenen Metaboliten getestet werden.

8. Wiederherstellung des Mikroinjektionssystems

1. Demontieren Sie den Polyethylenschlauch von der Mikroliterspritze.
2. Injizieren Sie mit der Insulinspritze Luft in das Röhrchen, um das destillierte Wasser im Polyethylenröhrchen zu entsorgen. Leeren Sie die Mikroliterspritze.
3. Drücken Sie auf dem Konfigurationsbildschirm auf Reset Pos, um den Bildschirm zur Definition der Spritzenstoppfigur zu öffnen (Abbildung 3C).
4. Drücken Sie Withdraw, bis ein Piepton ertönt, um die Mikroinjektionspumpe in die vollständig zurückgezogene Position zurückzusetzen (Abbildung 3C).
5. Kehren Sie zum Befehlsbildschirm zurück, und schalten Sie den Mikroinjektionscontroller aus, wenn auf diesem Bildschirm das Zeichen **END REACHED** angezeigt wird (Abbildung 3C).

Ergebnisse

Abbildung 1: Implantation der kommerziellen Führungskanüle bei Mäusen. (A) Das repräsentative Bild einer handelsüblichen Führungskanüle, eines Dummys und eines Injektors. (B) Das repräsentative Bild einer kommerziellen Führungskanüle und ein...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41	Pfizer	n/a
Flaschenaufsatz-Vakuumfilter, 500 mL, 0,22 μm, PES, steril	NEST	121921LA01
CaCl₂	Sigma-Aldrich	C1016	ACSF: 0,14 g/L
Chlorhexidin-Peeling 2%	Phoenix	NDC 57319-611-09
Chlorhexidin-Lösung	Phoenix	NDC 57319-599-09
Kommerzieller Dummy	RWD Life Science	62004	Single_OD 0,20 mm/ M3,5/G = 0,5 mm
Kommerzielle Führungskanüle	RWD Life Science	62104	Single_OD 0,41 mm-27G/ M3,5/C = 2,5 mm
Kommerzieller Injektor	RWD Life Science	62204	Single_OD 0,21 mm-33G/ Passend für M3,5/C = 3,5 mm/G = 0,5 mm
D-(+)-Glukose	Sigma-Aldrich	G8270	ACSF: 0,61 g/L
Dental-Acryl	HYGENIC	n/a
Befestigungsschrauben	RWD Life Science	62521
Pferdeserum	ThermoFisher Scientific	16050130
Insulinspritzen	BBraun	XG-LBB-9151133S-1BX	1 mL
Isofluran	Panion & BF biotech	DG-4900-250D
KCl	Sigma-Aldrich	P3911	ACSF: 0,19 g/L
Ketoprofen	Swiss Pharmaceutical	n/a
Lidocain	AstraZeneca	n/a
Niedriger Schmelzpunkt	Agarose Invitrogen	16520
MgCl₂	Sigma-Aldrich	M8266	ACSF: 0,19 g/L
Objektträger	ThermoFisher Scientific	4951PLUS-001E
Mineralöl light, weiß NF	Macron Fine Chemicals	MA-6358-04
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	ACSF: 7,46 g/L
NaH₂PO₄	Sigma-Aldrich	S8282	ACSF: 0,18 g/L
NaHCO₃	Sigma-Aldrich	S5761	ACSF: 1,76 g/L
n-Butylcyanacrylat-Klebstoff (Gewebekleber)	3M	1469SB	3M
Vetbond Neural Tracer	Santa Cruz	SC-358883	FluorGold
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148
Polyethylen-Tube	RWD Life Science	62329	OD 1,50, I.D 0,50 mm und OD 1,09, I.D 0,38 mm
Puralube Vet (Auge) Salbe	Dechra	12920060
Natriumacetat	Sigma-Aldrich	S2889	SCFAs: 13,5 mM
Natriumazid	Sigma-Aldrich	S2002
Natriumbutyrat	Sigma-Aldrich	B5887	SCFAs: 8 mM
Natriumpropionat	Sigma-Aldrich	P1880	SCFAs: 5,18 mM
Edelstahl-Führungskanüle	Chun Ta Edelstahlunternehmen CO., LTD.	n/a	AD 0,63 mm; Lokaler Anbieter
Edelstahl-Injektor	Chun Ta Edelstahlunternehmen CO., LTD.	n/a	AD 0,3 mm; Dummy besteht aus Injektor; lokaler Anbieter
Sekundenkleber	Krazy Glue	KG94548R
Triton X-100	Merck	1.08603.1000
Ausrüstung
Kanülenhalter	RWD Life Science	B485-68217
Deckenkamera	FOSCAM	R2
Digitale stereotaktische Instrumente	Stoelting	51730D
Präpariermikroskop	INNOVIEW	SEM-HT/TW
Glasperlensterilisator	RWD Life Science	RS1501
Heizkissen	Stoelting	53800M
Mikro-Präparierzange	ROBOZ	RS-5136	gezackt, leichte Wölbung; Extra zart; 0,5 mm Spitzenbreite; 4" Länge
Mikro-Präparierschere	ROBOZ	RS-5918	4,5" abgewinkelt Sharp
Mikroinjektions-Controller	World Precision Instruments (WPI)	MICRO2T	SMARTouch Controller
Mikroinjektionsspritzenpumpe	World Precision Instruments (WPI)	UMP3T-1	UltraMicroPump3
Mikroliter-Spritze	Hamilton	80014	10 μL
Optische Faser Kaltes Licht mit doppelter Faserstufe		LGY-150	Lokaler Anbieter
Haustiertrimmer	WAHL	09962-2018
Software
Tierverhaltens-Videoverfolgungssoftware	Noldus	EthoVision	Version: 15.0.1416