Schwann-Zell-ausgesiedelte Leitungen für die axonale Regeneration nach Rückenmarksverletzungen

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Lee, Y., et.al. Transplantation von Schwann-Zellen in PVDF-TrFE-Leitungen zur Überbrückung von durchtrennten Rückenmarksstümpfen von Ratten zur Förderung der Axonregeneration über die Lücke. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video zeigt die Verwendung eines piezoelektrischen Polymerkanals, der mit Schwann-Zellen besiedelt ist, um die Axonregeneration in einem durchtrennten Rückenmark einer Ratte zu fördern. Die Leitung sorgt für die strukturelle Führung, während ihre bioelektrischen Eigenschaften das Wachstum von Neuriten stimulieren. Schwann-Zellen innerhalb des Conduits sezernieren neurotrophe Faktoren, die die axonale Überbrückung zwischen den rostralen und kaudalen Stümpfen unterstützen.

Protokoll

Alle Verfahren, bei denen Tiermodelle zum Einsatz kommen, wurden von der örtlichen institutionellen Tierpflegekommission und der tierärztlichen Prüfstelle der JoVE überprüft.

1. Durchtrennung bei T8

Platzieren Sie den Retraktor um T7 bis T9. Sobald alle Laminae entfernt sind, stellen Sie sicher, dass die Lücken zwischen den Querfortsätzen sichtbar sind, insbesondere bei T8. Untersuchen Sie auch die Knochen entlang der Länge auf beiden Seiten zwischen T7 und T9, um sicherzustellen, dass keine Knochenfragmente nach außen ragen.
HINWEIS: Diese Lücke bei T8 ist wichtig für die Durchführung der vollständigen Durchtrennung. Die Wirbel entlang der Länge sollten entfernt werden, um das Einführen des Schlauchs zu erleichtern.
Schneiden Sie die dorsalen und ventralen Wurzeln oberhalb und unterhalb von T8 mit einer abgewinkelten Federschere ab. Geben Sie Kochsalzlösung in das Rückenmark und warten Sie, bis das Blut gerinnt.
HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig für die korrekte Einführung des Schlauchs.
Platzieren Sie die abgewinkelte Federschere oberhalb des Rückenmarks in den Lücken zwischen den Querfortsätzen bei T8 und machen Sie einen Schnitt, um das Rückenmark vollständig zu durchtrennen. Legen Sie ein kleines Stück komprimierten Schaumstoff in den entstandenen Spalt von 2-2,5 mm und geben Sie sofort Kochsalzlösung auf die Stelle.

2. Conduit insertion

Während Sie darauf warten, dass die durchtrennten Nabelschnurstümpfe die Blutstillung erreichen, nehmen Sie eine Leitung von 1x PBS heraus. Schneiden Sie die Absorptionsdreiecke in dünne lange Stücke und legen Sie sie in den Schlauch, um überschüssiges PBS zu entfernen. Vergewissern Sie sich, dass die vorgestanzten Fenster geöffnet sind.
Entfernen Sie Kochsalzlösung und Blut mit dünnen, langen Stücken von Absorptionsdreiecken. Heben Sie die beiden Stümpfe des Rückenmarks mit einem Mikrospatel an, um einen guten Abstand zu gewährleisten. Heben Sie den rostralen Stumpf vorsichtig mit dem Mikrospatel an und schieben Sie das Rohr mit den Fenstern zu sich selbst über den Baumstumpf. Stellen Sie sicher, dass der gesamte Stumpf eingeführt ist und keine übermäßigen Blutungen in die Leitung gelangen
Heben Sie den Schwanzstumpf vorsichtig an und schieben Sie das andere Ende des Rohrs über den Baumstumpf. Achten Sie darauf, dass der gesamte Stumpf eingesetzt ist und sich die Fenster auf der Rückenfläche befinden (Abbildung 1A).

3. Vorbereitung und Injektion der Schwann-Zelle(SC)/ injizierbare Matrix

: Während Sie darauf warten, dass der durchtrennte Strang die Blutstillung erreicht, entfernen Sie das Medium über dem GFP-SC-Pellet. Resuspendieren Sie die GFP-SC in 10 μl kaltem DMEM/F12. Geben Sie 10 μl kaltes injizierbares Gel in die Zellsuspension und mischen Sie es durch wiederholtes Pipettieren gut. Bewahren Sie die Mischung aus GFP-SC/DMEM/F12/injizierbarer Matrix auf Eis auf, bis das Einführen des Leiters abgeschlossen ist.
Nachdem Sie sichergestellt haben, dass die Fenster auf der dorsalen Oberfläche geöffnet sind (Abbildung 1A), injizieren Sie 20 μl des Gemischs aus GFP-SC/DMEM/F12/injizierbarer Matrix mit einer Western-Blot-Ladespitze und einer Mikropipette durch eines der vorgestanzten Fenster in den Rohr. Sollte das SC/DMEM/F12/injizierbare Matrixgemisch den Kanal überfüllen, entfernen Sie den Überschuss mit Absorptionsdreiecken. Schließen Sie die Fenster nach der Injektion; Ein Nähen ist nicht erforderlich (Abbildung 1B).

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Ergebnisse

Abbildung 1: Schließen des Fensters nach SC/DMEM/F12/Matrix-Injektion. Das Öffnen der Fenster erfolgt durch Zurückklappen jeder Klappe, nachdem die Leitung zwischen rostralen und kaudalen Stümpfen (A) platziert wurde. Die Fenste...