Method Article

Die Anwendung eines Maus Ligierte Peyer-Patch-Darmschlinge Assay zu bakterielle Aufnahme von M-Zellen auswerten

DOI:

10.3791/3225

December 17th, 2011

In This Article

Summary

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M-Zellen in einem spezialisierten Follikel-assoziierte Epithel Peyer-Plaques eine wichtige Rolle spielen für die Schleimhaut Immunüberwachung im Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe. Hier beschreiben wir die Auswertungsverfahren für die bakterielle Transzytose von M-Zellen In vivo. Diese Methode stellt eine Methode zur M-Zell-Funktion im Immunsystem zu verstehen.

Abstract

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Das Innere unseres Darms ist mit enormen Anzahl von symbiotischer Bakterien besiedelt. Die Schleimhautoberfläche des Magen-Darm-Trakt ist ständig mit ihnen und gelegentlich, um Krankheitserreger ausgesetzt. Der Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe (GALT) spielen eine Schlüsselrolle für die Induktion der mukosalen Immunantwort auf diese Mikroben 1, 2. Zur Initiierung der mukosalen Immunantwort, muss die Schleimhautzellen Antigene aus dem Darmlumen in das Epithel in organisierte lymphoide Follikel, wie Peyer-Plaques transportiert werden. Dieses Antigen Transzytose wird von spezialisierten epithelialen Zellen M 3, 4 vermittelt. M-Zellen sind atypische Epithelzellen, die sich aktiv phagozytieren Makromoleküle und Mikroben. Im Gegensatz zu dendritischen Zellen (DCs) und Makrophagen, die Ziel-Antigene zu Lysosomen zum Abbau, M-Zellen hauptsächlich transcytose die verinnerlichten Antigene. Diese kräftige makromolekularen Transzytose durch M-Zellen liefert Antigen auf die zugrunde liegende organisierte lymphoide Follikel eind ist vermutlich wesentlich für die Einleitung Antigen-spezifische mukosale Immunantworten. Allerdings sind die molekularen Mechanismen der Förderung dieses Antigen-Aufnahme durch M-Zellen weitgehend unbekannt. Wir haben bereits berichtet, dass Glykoprotein 2 (GP2), insbesondere auf der apikalen Plasmamembran der M-Zellen unter Enterozyten exprimiert, als transcytotic Rezeptor für eine Teilmenge von Kommensalen und pathogene Enterobakterien, darunter Escherichia coli und Salmonella enterica Serovar Typhimurium (S. typhimurium dient ), durch die Anerkennung FimH, eine Komponente des Typ-I-Pili auf der bakteriellen äußeren Membran 5. Hier stellen wir eine Methode für die Anwendung einer Maus Peyer-Patch Darmschlinge Test auf bakterielle Aufnahme durch M-Zellen zu bewerten. Diese Methode ist eine verbesserte Version der Maus Darmschlinge Assay zuvor beschriebenen 6, 7. Die verbesserte Punkte sind wie folgt: 1. Isofluran wurde als Narkotikum verwendet. 2. Etwa 1 cm ligiert Darmschlinge einschließlichIng. Peyer-Patch wurde eingerichtet. 3. Bakterien durch M-Zellen aufgenommen wurden Fluoreszenz durch Fluoreszenzmarkierung Reagenz oder durch Überexpression fluoreszierenden Proteins, wie grün fluoreszierende Protein (GFP) markiert. 4. M-Zellen in der Follikel-assoziierte Epithel Peyer-Patch wurden von insgesamt-mount immunostainig mit anti Gp2 Antikörper nachgewiesen. 5. Fluoreszierende Bakterien Transzytose von M-Zellen wurden durch konfokale mikroskopische Analyse beobachtet. Die Maus Peyer-Patch Darmschlinge Test liefern könnte die Antwort, welche Art von Kommensalen oder pathogenen Bakterien durch M-Zellen transcytosed und kann uns dazu bringen, den molekularen Mechanismus, wie mukosalen Immunsystems durch M-Zellen zu stimulieren verstehen.

Protocol

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1. Vorbereitung von Bakterienzellen

  1. Streak Glycerin gefüllt fluoreszierende Bakterien (z. B. GFP-exprimierenden S. typhimurium) auf LB-Agar-Platte mit 100 ug / ml Ampicillin.
  2. Kultur einer einzelnen Kolonie von LB-Agar über Nacht in 2 ml der neuen LB-Medium.
  3. 0,5 ml Bakterienkultur zu 4,5 ml der neuen LB-Medium und Inkubation bis optischen Dichte von 1,0 bei 600 nm erreicht ist.
  4. Ernte Bakterienzellen durch Zentrifugation (3.000 xg, 5 min, 4 ° C).
  5. Überstand verwerfen und waschen zweimal mit 5,0 ml sterilem Phosphatpuffer (PBS).
  6. Resuspendieren Bakterienpellet mit 5 ml PBS, und verwenden Sie 50 ul der S....

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Discussion

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Die Inkubationszeit von ligiert Peyer-Patch mit Bakteriensuspension ist in der Regel für 1 Stunde, um die bakterielle Einbau in M-Zellen zu beobachten. Im Falle von 4 Stunden Inkubation werden die Bakterien oft in der T-Zell-Zone der Peyer-Plaques nachgewiesen. Wie das verdampfte Isofluran inhalant Anästhesie halten konnte Mäusen stabil ist, ist die Inkubationszeit von ligiert Peyer-Patch mit Bakteriensuspension erweiterbar, um die Bakterien, die in T-Zell-Zone in die Peyer-Patch bewegen zu beobachten. Der wichtig.......

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Disclosures

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgements

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Die Autoren bedanken sich bei allen EIB-Mitglieder für die Entwicklung dieser Technik zu danken. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Grant-in-Aid for Scientific Research auf Priority Areas "Membrane Traffic" (HO) und "Matrix of Infectious Phenomena" (KH), Young Scientists (SF und KH) und Wissenschaftliche Forschung (HO unterstützt ) und Scientific Research on Innovative Areas "Intrazelluläre Logistik" (HO), vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie in Japan.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Name des Reagenzes Firma Katalog-Nummer Kommentare (optional)
LB Agar Ampicillin-
100
SIGMA L5667
Cy3 mono-Reactive
Dye-Pack
GE Healthcare PA23001
Alexa Fluor 350
Carbonsäure,
Succinimidylester
Invitrogen A10168
Inhalationsnarkose
Apparat
Shinano Seisakusho SN-487
Fixation und
Permeabilisierung
Lösung
BD 554722
Anti-Maus
Glycoprotein 2
Antikörper
MBL D278-3 200-facher Verdünnung (5μg/ml)
Goat Anti-Rat IgG,
F (ab ') 2-Fragment
spezifisch
Jackson
ImmunoResearch
112-505-006 200-facher Verdünnung (20μg/ml)
Alexa Fluor 633
Phalloidin
Molecular Probes A22284 50-facher Verdünnung
Konfokalen Laser
Scanning-Mikroskop
Leica Microsystems DMIRE2
DeltaVision
Restaurierung
Dekonvolution
Mikroskop
Applied Precision DeltaVision Core-

References

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  1. Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3, 63-72 (2003).
  2. Hapfelmeier, S. Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses. Scienc....

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