Kohärente Anti-Stokes-Raman-Spektroskopie zur Visualisierung myelinisierter Neuronen im Hirngewebe von Mäusen

Zusammenfassung

Quelle: McCullagh, E. A., et al. Kohärente Anti-Stokes-Raman-Spektroskopie (CARS) Anwendung zur Bildgebung der Myelinisierung in Hirnschnitten. J. Vis. Exp. (2022)

Das Video zeigt die Fluoreszenz und die Bildgebung der kohärenten Anti-Stokes-Raman-Spektroskopie (CARS) zur Visualisierung der neuronalen Architektur im Hirngewebe von Nagetieren. Die Nissl-Färbung markiert Zellkörper durch Bindung an ribosomale RNA, während die CARS-Bildgebung durch laserinduzierte Signale auf lipidreiches Myelin abzielt. Die Überlagerung der Fluoreszenz- und CARS-Bilder ermöglicht eine detaillierte Ansicht von Zellkörpern und myelinisierten Axonen.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.

1. Färben

von

1. frei schwebenden Schnitten für Nissl, zur Visualisierung von Zellkörpern (1:100), in Antikörpermedien (AB-Medien: 0,1 M Phosphatpuffer (PB: 50 mM KH2PO4, 150 mM Na2HPO4), 150 mM NaCl, 3 mM Triton-X, 1% Rinderserumalbumin (BSA)) für 30 min bei Raumtemperatur auf einem Standard-Laborschüttler.
   1. Schützen Sie die Abschnitte mit Aluminiumfolie und/oder einer Abdeckung vor Licht. Wellenlängen von 550 nm oder darunter sind mit der CARS-Bildgebung kompatibel (Abbildung 1).
      HINWEIS: Wir gehen zwar nicht davon aus, dass Triton-X oder andere Reagenzien einen Einfluss auf die CARS-Bildgebung von Lipiden haben, aber zusätzliche Kontrollen mit spezifischen Antikörpermedien können gerechtfertigt sein.
2. PAUSE POINT: Lagern Sie frei schwebende Abschnitte (unter Lichtschutz) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bis zur Bildgebung. Nach der Sektion stellen Sie die Gehirnschnitte innerhalb von 2 Wochen dar.

2. Imaging HINWEIS

: Der CARS-Laseraufbau besteht aus einem Faserlaser, der den Takt von 80 MHz liefert, und einem OPO-Laser (Optical Parametric Oscillator) mit einem abstimmbaren Bereich von 770-990 nm, wobei der Stokes-Strahl auf 1031 nm festgelegt ist, die zum Sammeln des CARS-Signals benötigt werden. Es gibt eine Öffnung für beide Strahlen.

1. Bevor Sie die Proben zum Mikroskop bringen, schalten Sie den CARS-Laser ein und erwärmen Sie ihn für mindestens 1 h, richten Sie den CARS-Laser und Koehler die Kondensoroptik und die Blende des Mikroskops für die CARS-Bildgebung aus.HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend für die ordnungsgemäße Funktion der CARS-Mikroskopie.
   1. Für die räumliche Ausrichtung der beiden Laserstrahlen (Pump und Bokes) greifen Sie über die CARS Laser GUI (grafische Benutzeroberfläche) auf die beiden internen PSDs (positionsempfindliche Detektoren) zu.
   2. Erreichen Sie eine zeitliche Ausrichtung mit der Verzögerungsfunktion in der CARS-Laser-GUI, die dazu beitragen kann, die Pulse der beiden Laser (Pump und Stokes) zu überlappen, die aufgrund ihrer unterschiedlichen Wellenlängen unterschiedliche Dispersionen aufweisen. Daher erfolgt sowohl die zeitliche als auch die räumliche Überlappung der Pump- und Stokes-Strahlen mit der Benutzereingabe über die GUI.
   3. Stellen Sie das externe Periskop (die letzten beiden Spiegel des Setups) so ein, dass die beiden räumlich überlappenden Laser auf den Scankopfspiegeln des Mikroskops zentriert werden.
   4. Um eine optimale Erkennung von nicht degescannten CARS nach vorne zu erzielen, stellen Sie sicher, dass der Kondensor Koehler-ed ist (d. h. der Kondensor ist zentriert und auf die Membran fokussiert, um eine gleichmäßige Ausleuchtung zu erzielen)
2. Für die konfokale Immunfluoreszenz-Bildgebung und die CARS-Bildgebung ist der CARS-Laser sowohl mit Vorwärts- als auch mit epi-CARS-Detektoren (Non-Descan-Detektoren, NDDs) auszustatten, indem Sie ein konfokales Mikroskop einbauen, das mit sichtbaren Lasern für die Fluoreszenzbildgebung ausgestattet ist (Abbildung 2).
3. Legen Sie die Schnitte in eine Kulturschale mit Deckglas (für invertierte Mikroskopie), PBS, um ein Austrocknen des Gewebes zu vermeiden, und einem Glasgewicht, um das Gewebe in der Nähe des Deckglases zu halten.
4. Nehmen Sie Z-Stapel oder Einzelbilder mit einem infrarotkorrigierten Wasserobjektiv mit 60X und numerischer Apertur (NA) von 1,2 auf, das zum Sammeln des CARS-Signals in Epi-Richtung und durch einen 0,55-NA-Kondensator in Vorwärtsrichtung zur Abbildung von Hirnbereichen wie dem medialen Kern des Trapezkörpers (MNTB) dient.
   1. Nehmen Sie die CARS-Bilder mit ca. 600 mW Pumpe/Sonde und 300 mW Stokes auf, indem Sie die CARS-Laser-GUI verwenden. Diese Laserleistungswerte werden systemintern gemessen. Die Leistung beider Laser an der Probenstelle beträgt weniger als 25 mW und ist sicher für die Gewebeprobe.
   2. Überlappen Sie die Pumpen- und Stokes-Strahlen räumlich und zeitlich. Stimmen Sie den OPO auf 797.2 nm. Daraus ergibt sich eine CARS-Wellenlänge von 650 nm. Aufgrund des höheren Energieniveaus ist die resultierende Rückkehr in den Grundzustand anti-Stokes (blau verschoben) zur Anregung.
   3. Erfassen Sie das CARS-Signal in Epi- oder Forward-Detektoren ohne Descan unter Verwendung von Bandpassfiltern (640-680 nm), gefolgt von der sequentiellen Detektion der Immunfluoreszenzmarkierung (in diesem Fall fluoreszenzmarkierte Nissl). Anmerkung: Der neuronale Soma-Marker von Nissl wird nicht im CARS 640-680 nm Bandpassfilter erfasst, so dass die Kombination von Fluoreszenz- und CARS-Bildgebung in den unten gezeigten Bildern möglich ist.
   4. Das CARS und die Fluoreszenz teilen sich keine PMTs. Verwenden Sie diese Einstellungen für ein optimales Lipidsignal, um die Myelinisierung im Gehirnbereich selektiv abzubilden. Vorsicht: Schirmen Sie den Benutzer vor dem Laserstrahl
5. ab Speichern Sie die Bilder als .oib-Dateien, die zur weiteren Quantifizierung in ein Bildanalyseprogramm importiert werden können (Abbildung 3).

Ergebnisse

Abbildung 1: CARS-Bildgebung kann mit Immunfluoreszenz-Bildgebung kombiniert werden. Die Grafik zeigt, dass die CARS-Bildgebung im roten Signalspektrum von 660/640 nm erfolgt. Diese Wellenlänge ist ausreichend weit vom grünen, blauen oder UV...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Färben:
AB Medien:			1n 1.000 ml Millipore H2O
Phosphat gepuffert (PB):
Kaliumphosphat Monobase	Sigma	P5655
Natriumphosohat Dibasic	Sigma	S7907
BSA (Rinderserumalbumin)	Sigma life science	A2153-100g
Natriumchlorid	Fisher Chemical	s271-1
Triton X-100	Sigma - Aldrich	x100-500ml
Nissl 435/455	Invitrogen	N21479
CARS:
APE picoemerald laser	Angewandte Physik & Elektronik GmbH
Bandpassfilter (420-520 nm)	Chroma Technology	HQ470/100m-2P
Bandpassfilter (500-530 nm)	Chroma Technology	HQ515/30m-2P
Bandpass Filter (640-680 nm)	Chroma Technology	HQ660/40m-2P
Konfokales Mikroskop	Olympus	FV1000
Cut Transfer Pipette	Fisher	13-711-7M
dichroitischer Langpass 565 nm	Chroma Technology	565dcxr
dichroitischer Langpass 585 nm	Chroma Technology	585dcxr
dichroitischer Kurzpass 750 nm	Chroma Technology	T750spxrxt
Glasbodenkulturschale	MatTek	P35G-0-10-C
Glasgewicht (10 mm x 10 mm Borstäbchen)	Allen Scientific Glass Inc
Multiphotonen-Kurzpass-Emissionsfilter 680 nm	Chroma Technology	ET680sp-2p8
PBS