Bildgebung der Kalziumdynamik in Seitenlinien-Haarzellen von Zebrafischlarven

Zusammenfassung

Quelle: Lukasz, D., et al. In vivo Calcium-Bildgebung von Seitenhaarzellen bei Zebrafischlarven. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt eine Live-Bildgebung des Kalziumeinstroms in den Seitenlinien-Haarzellen einer gelähmten transgenen Zebrafischlarve mit einem konfokalen Mikroskop. Die mechanische Stimulation der Haarbündel über Flüssigkeitsimpulse induziert den Kalziumeintrag über Mechanotransduktionskanäle und spannungsgesteuerte Kanäle, der in Echtzeit mit Hilfe von Fluoreszenzindikatoren sichtbar gemacht wird. Die Methode hebt die apikale und basale Kalziumdynamik in Neuromast-Haarzellen hervor und klärt ihre Rolle bei der Erkennung von Wasserbewegungen auf.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Feststecken und Immobilisieren der Larve in der Bildgebungskammer
   1. Baden einer Tg(myo6b:GCaMP6s-caax)-Larve in ca. 1 ml Embryopuffer (E3)-Puffer, der 0,04% MS-222 enthält, für 1–2 min auf der Silikonverkapselungsoberfläche der Bildgebungskammer, bis die Larve unbeweglich wird oder nicht mehr auf Berührung reagiert.
      1. Positionieren Sie die Larve unter einem Stereomikroskop in der Mitte der Perfusionskammer, so dass sie flach auf der Seite gegen das Silikonverkapselungsmittel anliegt.
         HINWEIS: Aus Gründen der Konsistenz montieren Sie die Larven immer auf der gleichen Seite (z. B. mit der rechten Seite nach unten, mit der linken Seite nach oben) (Abbildung 2B1).
   2. Führen Sie mit einer feinen Pinzette einen 0,035 mm Kopfstift senkrecht zur Larve und zur Kammer nach unten. Führen Sie den Kopfstift zwischen dem Auge und dem Vesikel oticum nach unten in das Verkapselungsmittel ein (Abbildungen 1B1 und 1B2). Verwenden Sie eine zweite Pinzette, um die Larve entlang ihrer dorsalen oder ventralen Seite zu stabilisieren, während Sie feststecken. Stellen Sie sicher, dass der horizontale Teil des Stifts die Larve berührt und nicht ganz in das Verkapselungsmittel drückt. Winkeln Sie den Stift ventral an (Abbildung 1B1) oder zeigen Sie leicht in Richtung des vorderen Teils des Fisches, um eine Beeinträchtigung der nachfolgenden Herzinjektion und der Bildgebung von Haarzellen zu vermeiden.
      Führen
      1. Sie mit der Pinzette einen 0,025 mm langen Schwanzstift so nah wie möglich am Ende des Schwanzes in die Chord ein (Abbildung 1B1).
         HINWEIS: Achten Sie darauf, die Larve nicht zu dehnen. Stecke die Larve flach. Die Augen sollten überlagert sein (Abbildung 2B1). Dies ist sehr wichtig für die Erleichterung der Herzinjektion (Abbildung 1B2-B2', Schritt 3), die Erleichterung einer wünschenswerten Bildgebungsebene (Abbildung 1B1-B2'', Schritt 5) und die Quantifizierung der Intensität des Flüssigkeitsstrahl-Stimulus (Abbildung 3A3, Schritt 4).
2. Injektion von α-Bungarotoxin in die Herzhöhle, um die Larve zu lähmen

HINWEIS: Tragen Sie beim Umgang mit α-Bungarotoxin Handschuhe.

1. Zentrifugieren Sie das α-Bungarotoxin-Aliquot kurz vor der Verwendung, um ein Verstopfen der Herzinjektionsnadel zu verhindern.
   1. Füllen Sie 3 μl α-Bungarotoxin-Lösung mit einer Gelladepipettenspitze in eine Herzinjektionsnadel ein. Laden Sie die Lösung gleichmäßig und ohne Blasen bis zur Spitze auf.
   2. Führen Sie die Herzinjektionsnadel in einen Pipettenhalter ein, der an einem manuellen Mikromanipulator befestigt ist. Positionieren Sie die Nadel unter einem Stereomikroskop so, dass sie senkrecht zur A-P-Achse der festgenagelten und anästhesierten Larven ausgerichtet ist und in einem Winkel von ~30° nach unten zeigt.
   3. Verbinden Sie den Pipettenhalter mit dem Druckinjektor. Wenden Sie die folgenden empfohlenen Einstellungen an: Pinjection = 100 hPa, Tinjection = 0,5 s und Pcompensation = 5 hPa. Injiziere einen Bolus in die Lösung, um zu testen, ob die Nadelspitze offensichtlich ist.
   4. Achte auf einen kleinen Hauch der roten Lösung (von Phenolrot), um die Spitze der Nadel zu verlassen. Wenn keine rote Farbe zu sehen ist, kratzen Sie die Nadelspitze sehr vorsichtig gegen die Kante einer Stecknadel und versuchen Sie es erneut, bis die Nadel sichtbar ist. Alternativ kannst du eine Nadel mit einer größeren Spitzenöffnung ziehen.
2. Schieben Sie die Nadel in Richtung Herz, bis sie die Haut außerhalb des Herzens berührt (Abbildung 1B2). Drücken Sie die Nadel in die Larve und suchen Sie nach einer Vertiefung der Pigmentzelle auf der Haut vor dem Herzen, um sicherzustellen, dass die Nadel in der richtigen Ebene relativ zur Larve positioniert ist (Abbildung 1B2).
   1. Schiebe die Nadel weiter voran, bis sie die Haut durchbohrt und in die Herzhöhle eintritt. Ziehe die Nadel etwas zurück. Injizieren Sie einen Bolus α-Bungarotoxin in die Herzhöhle. Achten Sie auf eine Aufblähung der Herzhöhle oder auf roten Farbstoff, der in die Herzhöhle eindringt.
3. Spülen Sie die Larve 3 Mal vorsichtig mit 1 ml neuronalem Puffer (NB) aus, um das restliche MS-222 zu entfernen. Entfernen Sie niemals die gesamte Flüssigkeit. Halten Sie die Larve in etwa 1 ml NB in der Perfusionskammer.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Herzschlag und der Blutfluss der Larven nach dem Fixieren und der Herzinjektion und während des gesamten bildgebenden Experiments robust bleiben.
4. Vorbereitung des Mikroskop- und Fluid-Jet-Setups
   1. Baue ein aufrechtes konfokales Mikroskop mit den in der Materialtabelle beschriebenen Komponenten zusammen: ein konfokales Mikroskop mit einem 488 nm Laser und entsprechenden Filtern, Mikroskopsoftware zur Steuerung und Koordination von Bildgebung und Stimulation, 10x Luftobjektiv, 60x Wasserobjektiv, Piezo-Z-Objektivscanner (für Z-Stacks), Hochgeschwindigkeitskamera, kreisförmige Kammer Adapter, motorisierter Tisch und Tischeinsatzadapter.
   2. Bauen Sie den Flüssigkeitsstrahl zusammen, der aus 3 Hauptkomponenten besteht: einer Vakuum- und Druckpumpe, einer Hochgeschwindigkeits-Druckklemme und einer Kopfstufe (auch in der Materialtabelle beschrieben). Verwenden Sie die Hochgeschwindigkeits-Druckklemme, um den Zeitpunkt und die Dauer der Druck- oder Vakuumentladung aus dem Kopftisch in die Fluidstrahlpipette zu steuern.
      1. Verbinden Sie den Ausgang des Kopftisches über einen dickwandigen Silikonschlauch mit dem Flüssigkeitsstrahl-Pipettenhalter.
5. Ausrichtung von Larve und Fluidstrahl

HINWEIS: In jedem Neuromast gibt es 3 interessante Ebenen: (1) die Spitzen der Haarbündel (Abbildung 3A3: die Kinozilien, die zur Messung der Reizintensität verwendet werden); (2) die Mechanotransduktionsebene (MET) des Haarbündels (Abbildung 2B1-B1': die Basis der apikalen Haarbündel, an der MET-Kanal-abhängige Kalziumsignale detektiert werden); und (3) die synaptische Ebene (Abbildung 2B2-B2': wo präsynaptische Kalziumsignale an der Basis der Haarzelle detektiert werden). Diese Ebenen sind in Abbildung 2A dargestellt.

1. Füllen Sie 10 μl NB mit einer Gelladespitze in eine ordnungsgemäß gebrochene Flüssigkeitsstrahlnadel auf. Laden Sie die Lösung gleichmäßig und ohne Blasen bis zur Spitze auf. Führen Sie die Nadel in den Pipettenhalter ein, der am motorisierten Mikromanipulator befestigt ist.
2. Setzen Sie die Perfusionskammer in einen kreisförmigen Kammeradapter auf dem Mikroskoptisch ein. Anmerkung: Um die Konsistenz zu gewährleisten, positionieren Sie die Larve immer in der gleichen Ausrichtung (z. B. die Kammer, in der sich die Larve befindet, mit der hinteren Seite zum Flüssigkeitsstrahl und der ventralen Seite zum Experimentator).
   1. Bewegen Sie den motorisierten Tisch so, dass sich die Larve in der Mitte des Sichtfeldes befindet. Drehen Sie den Kreiskammeradapter so, dass die anteroposteriore (A-P) Achse der Larve ungefähr mit der Flugbahn der Flüssigkeitsstrahlnadel ausgerichtet ist.
   2. Bringen Sie die Larve mit Durchlicht und differentiellem Interferenzkontrast (DIC) in den Fokus und zentrieren Sie sie unter dem 10-fach-Objektiv. Erhöhen Sie das 10-fache Ziel.
3. Bringen Sie die Flüssigkeitsstrahlnadel mit dem motorisierten Mikromanipulator in die Mitte des Sichtfelds, so dass sie vom durchgelassenen Licht beleuchtet wird und die NB-Lösung kaum berührt.
   1. Senken Sie das 10-fache Ziel. Konzentrieren Sie sich auf die Larve, um ihren Standort zu bestätigen. Fokussieren Sie nach oben, um die Fluidstrahlnadel zu finden. Bewegen Sie die Fluidstrahlnadel mit dem Mikromanipulator in der x- und y-Achse, bis sie sich in einer Position parallel zur Rückenseite des Fisches befindet.
   2. Konzentrieren Sie sich wieder auf die Larve. Bringen Sie die Nadel in der z-Achse nach unten. Positionieren Sie die Nadel entlang der Rückenseite des Fisches und ~1 mm vom Körper entfernt (Abbildung 3A1).
   3. Bewegen Sie den Kreiskammeradapter vorsichtig (falls erforderlich), um sicherzustellen, dass die Flüssigkeitsstrahlnadel entlang der A-P-Mittellinie der Larve ausgerichtet ist (Abbildung 3A1).
   4. Bewegen Sie den motorisierten Tisch, um den interessierenden Neuromast in der Mitte des Sichtfelds zu platzieren. Halten Sie die Nadelspitze mit dem Flüssigkeitsstrahl entlang der Rückenseite des Fisches. Berühren Sie nicht die Spitze der Fluidstrahlnadel mit der Larve oder der Kammeroberfläche.
4. Wechsle zum 60x Wasserobjektiv. Stellen Sie sicher, dass das Ziel in die NB-Lösung eingebettet ist. Verwenden Sie den Feinfokus, um einen Neuromast mithilfe von Durchlicht und DIC-Optik zu lokalisieren.
   HINWEIS: Dieser Aufbau wurde entwickelt, um Neuromasten entlang der primären hinteren Seitenlinie zu stimulieren. Haarzellen innerhalb dieser Neuromasten reagieren entweder auf den vorderen oder den hinteren gerichteten Flüssigkeitsfluss.
   1. Positionieren Sie die Fluidstrahlnadel mit dem Mikromanipulator so, dass sie 100 μm vom äußeren Rand des Neuromastes entfernt ist (Abbildung 3A2).
      HINWEIS: Wählen Sie Neuromasten, die eine klare Draufsicht bieten (Abbildungen 2B1'-B2' und Abbildung 3A3) anstelle von seitlich abgewinkelten Ansichten (Abbildung 2C1-C2)). Eine klare Top-Down-Ansicht ermöglicht die gleichzeitige Bildgebung aller apikalen Haarbündel in einer einzigen optischen Ebene oder die Bildgebung synaptischer Areale in weniger optischen Ebenen (Abbildung 3A3).
   2. Fokussieren Sie sich bis zu den Spitzen der apikalen Haarbündel (Kinocilia) (Abbildung 1A, Abb. 3A2 und 3A3). Die Unterseite der Fluidstrahlnadel sollte in dieser Ebene scharf sein.
5. Stellen Sie die Hochgeschwindigkeits-Druckklemme vom manuellen in den externen Modus ein, um Eingaben von der Bildgebungssoftware zu erhalten.
   1. Setze die Hochgeschwindigkeits-Druckklemme auf Null, indem du die "Null"-Taste drückst. Stellen Sie mit dem Sollwertregler den Ruhedruck leicht positiv (~2 mmHg) ein. Bestätigen Sie den Ruheausgang der Hochgeschwindigkeits-Druckklemme mit einem Manometer von Pfund pro Quadratzoll (PSI), das an den Ausgang des Kopftisches angeschlossen ist.
      HINWEIS: Stellen Sie im Ruhezustand einen leicht positiven Druck ein, um die allmähliche Aufnahme von Flüssigkeit in die Flüssigkeitsstrahlnadel im Laufe der Zeit zu vermeiden. Wenn Flüssigkeit in den mit dem Flüssigkeitsstrahl verbundenen Schlauch eindringt und die Kopfstufe erreicht, kann dies das Gerät beschädigen.
   2. Bestimmen Sie den Druck, der erforderlich ist, um die Haarbündel zu stimulieren. Verwenden Sie einen 0,125- und einen 0,25-V-Eingang (6,25 und 12,5 mmHg) für 200 bis 500 ms, um einen Teststimulus anzuwenden (Abbildung 3A3-A3'').
      HINWEIS: Die Hochgeschwindigkeits-Druckzange wandelt einen Spannungseingang (von Software oder anderen Geräten, die an den Bajonett-Neill-Concelman-Anschluss (BNC) an der Hochgeschwindigkeits-Druckzange angeschlossen werden) in Druck um, der von der Kopfstufe abgeleitet wird. und schließlich die Fluidstrahlnadel (1,0 V = 50 mmHg, während -1,0 V = -50 mmHg). In dieser Konfiguration (siehe Schritt 4.2) lenkt der Überdruck (Push) die Haarbündel nach vorne und der Unterdruck (Pull) die Haarbündel nach hinten ab.
   3. Messen Sie mit Hilfe von Durchlicht und DIC-Optiken in Verbindung mit einem Maßstabsbalken den Ablenkungsweg durch die 6,25- und 12,5 mmHg-Reize der Spitzen der Haarbündel, der Kinozilien (Abbildung 2A und Abbildung 3A3-3''). Wählen Sie einen Druck, der die Bündel (als 1 kohäsive Einheit) über eine Strecke von ca. 5 μm bewegt (Abbildung 3A3''). Achten Sie darauf, dass die Spitzen der Kinozilien die ganze Zeit im Fokus bleiben.
   4. Bewegen Sie den Flüssigkeitsstrahl ± 25 μm entlang der A-P-Achse der Larve, um einen Abstand und Druck zu finden, der die Spitzen der Kinozilien um 5 μm ablenkt.
      HINWEIS: Bei Verwendung von GCaMP6s bei Larven 3–7 Tage nach der Befruchtung (dpf) sollte eine Ablenkung von 5 μm nahezu gesättigte GCaMP6s-Kalziumsignale erreichen und die apikalen Haarbündelstrukturen nicht beschädigen (Abbildung 3A3''). Kleinere Verschiebungsabstände können verwendet werden, um nicht-sättigende Reize zu liefern (Abbildung 3A3'). Verschiebungsabstände >10 μm sind schwer abzuschätzen (Abbildung 3A3''') und können im Laufe der Zeit schädlich sein. Die Signalsättigung ist abhängig vom Alter des Neuromastes (und der kinocilialen Höhe) sowie vom verwendeten Indikator. Überprüfen Sie während der Bildgebung regelmäßig die Durchgängigkeit der Flüssigkeitsstrahlnadel in jede Richtung (Druck/Druck und Vakuum/Zug). Fluidstrahlnadeln verstopfen leicht und verlieren die Durchgängigkeit des Vakuums, behalten aber die Restdruckdurchgängigkeit bei. Verwenden Sie eine DIC-Optik und einen kurzen Teststimulus in jede Richtung, um die Durchgängigkeit des Fluidjets zu überprüfen.
   5. Fokussieren Sie die Probe auf die interessierende Ebene (z. B. die Basis der apikalen Haarbündel oder die Basis der Haarzelle in der synaptischen Ebene; Abbildung 2B1-B2').
6. Verfahren zur Bildaufnahme: Einzelebenenerfassung

HINWEIS: Alle in diesem Protokoll beschriebenen Bildgebungen werden bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt.

1. Stellen Sie die Imaging-Software so ein, dass sie eine Streaming- oder kontinuierliche Erfassung mit 80 Bildern mit einer Aufnahme alle 100 ms erfasst, um eine Bildrate von 10 Hz zu erreichen.
2. Stellen Sie Verstärkung, Blende und Laserleistung ein, um die Signalerkennung zu optimieren, aber Sättigung, Photobleiche und Rauschen zu vermeiden. Beispieleinstellungen für einen Opterra/SFC sind wie folgt: 488 nm Laserleistung: 50 (Haarbündel-MET-Ebene), 75 (synaptische Ebene); 35 μm Spalt; Verstärkung = 2,7; EM-Verstärkung = 3900.
   HINWEIS: Wenden Sie 2 X Binning an, wenn die Signale zu schwach oder verrauscht sind oder übermäßiges Photobleaching aufweisen. 2-faches Binning verbessert die Signalerkennung auf Kosten der räumlichen Auflösung.
3. Wählen Sie einen Stimulus aus, der während der 80-Frame-Aufnahme (8 s) nach Frame 30 bei 3 s.
   HINWEIS: Einige Beispiel-Stimuli sind wie folgt: 200 ms (+ oder - 0,25 V) bis zu 2 s (+ oder - 0,25 V) Schritt in anteriorer oder hinterer Richtung, um die Richtungsempfindlichkeit jeder Haarzelle zu identifizieren; 2 s, 5 Hz Rechteckwelle (0,25 V für 200 ms, -0,25 V für 200 ms, 5 mal wiederholt) zur gleichzeitigen Stimulation aller Haarzellen. Ein positiver Druck (anteriorer Reiz) aktiviert die Hälfte der Haarzellen. Ein Unterdruck (hinterer Reiz) aktiviert die andere Hälfte der Haarzellen. Stellen Sie sicher, dass die Stimulussoftware oder das Gerät die Druckklemme nach Beendigung des Stimulus wieder auf 0 V zurücksetzt.
4. Messen Sie mechanosensitive Kalziumreaktionen. Fokussieren Sie sich auf die Basis der apikalen Haarbündel (Abb. 2A und 2B1-B1') und starten Sie die Bildaufnahme.
   HINWEIS: Wenn der Neuromast klar von oben nach unten betrachtet wird (Abbildung 2B1-B1'), können alle apikalen Haarbündel gleichzeitig in einer einzigen Ebene abgebildet werden.
5. Messen Sie präsynaptische Kalziumreaktionen. Fokussieren Sie auf die Basis der Haarzellen (Abbildungen 2A und 2B2-B2') und starten Sie die Bildaufnahme.
   HINWEIS: Wenn der Neuromast klar von oben nach unten betrachtet wird (Abbildung 2B2-B2'), können die präsynaptischen Bildgebungsebenen aller Haarzellen in 2-3 Ebenen im Abstand von 2 μm aufgenommen werden. Tg[myo6b:ribeye-mcherry] transgene Fische können verwendet werden, um präsynaptische Bänder und Stellen des Kalziumeintritts zu identifizieren und zu lokalisieren.

Ergebnisse

Abbildung 1: Bildgebungskammer, Zebrafisch-Montage und Herzinjektionsverfahren sowie Nadeln. (A) Gezeigt ist eine Bildgebungskammer mit einer Larve (umrandet durch ein gestricheltes Rechteck), die in der Mitte auf dem Silikonverkapselungsmitt...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
α-Bungarotoxin	R&D Systems	2133	Zur Lähmung von Larven vor der
Bildgebung Bildgebungskammer	Siskiyou	PC-R	Plattform zur Aufnahme von Larven für die Bildgebung
Nr. 1.5 Deckgläser quadratisch, 22*22 mm	VWR	48366-227	Zum Verschließen der Bildgebungskammer
Hochvakuum-Silikonfett	Fischer Scientific	14-635-5D	Zum Anbringen des Deckglases auf der Bildgebungskammer
Silikonverkapselungsmittel klar 0,5 g Kit	Ellsworth Adhesives	Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0,5 KG	Zum Befüllen der Bildgebungskammer, um eine Oberfläche zum Anstecken von Fischen
zu schaffen Stereomikroskop	Carl Zeiss Mikroskopie	Stemi 2000 mit Durchlichtbeleuchtung	Zum Beleuchten von Draht, Pinzetten und Scheren zum Herstellen von Stecknadeln
Feine Pinzette	Fine Science Tools	Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) Art.-Nr. 11295-10	Zum Herstellen von Stecknadeln
Feine Schere	Cole-Palmer	5,5", EW-10818-00	Zum Schneiden von Draht zum Herstellen von Stecknadeln
Wolframdraht, 0,035 mm	Goodfellow	W005131	Für Kopfstifte zum Immobilisieren von Larven
Wolframdraht, 0,025 mm	ThermoFischer Scientific	AA10405-H4	Für Schwanzstifte zur Ruhigstellung von Larven
Kapillaren aus Borosilikatglas ohne Filament	Sutter Instrument Company	B 150-86-10	Glas zum Einziehen in Fluid-Jet-Nadeln zur Stimulation von Haarzellen
Feine Pinzette	Fine Science Tools	Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) Artikel-Nr. 11295-10	Zum Feststecken von Larven
Gel Tipps zum Befüllen	Eppendorf	5242956003	Zum Verfüllen von Herzinjektionsnadeln
Stereomikroskop	Carl Zeiss Mikroskopie	Stemi 2000 mit Durchlichtbeleuchtung Zur	Beleuchtung von Larven beim Pinning und bei der Herzinjektion
Glaskapillar-/Nadelhalter	WPI	MPH315	Zum Halten von Fluidstrahlnadeln
Manueller Mikromanipulator	Narishige	M-152	Zum Halten und Positionieren des Nadelhalters zur Injektion von α-Bungarotoxin
Magnetstativ	Narishige	GJ-1	Zum Halten eines manuellen Mikromanipulators für die α-Bungarotoxin-Injektion
Druckinjektor	Eppendorf	Femtojet 4x	Zur Abgabe von α-Bungarotoxin
Konfokalmikroskop	Bruker	Swwept Field/Opterra Konfokalmikroskop	Festes, aufrechtes Mikroskop mit DIC-Optik und 488nm Laser mit entsprechenden Filtern
Mikroskopsoftware	Bruker	Prairieview 5.3	Zur Koordination und Steuerung von Mikroskop, Lasern, Tisch, Piezo-Z, Kameras und Fluidjet
10x Luftobjektiv	Nikon	MRH00101	Geringe Vergrößerung zur Positionierung von Larven und Fluidstrahl
60x Wasserobjektiv	Nikon	MRF07620	Wasserimmerison-Objektiv mit hoher NA (1,0) und ausreichendem Arbeitsabstand (2,0 mm)
Piezo-Z-Objektivscanner mit Controller/Treiber	Physik Intruments instruments/Bruker	01144210/UM-Z-PZ	Hochgeschwindigkeits-Z-Stack-Erfassung mit einer Genauigkeit von 0,025 μm
EMCCD-Kamera	QImaging	Rolera EM-C2 EMCCD-Kamera	Kamera mit kleiner Pixelgröße, die bis zu 100 Bilder pro s erfassen kann
Kreiskammeradapter	Siskiyou	PC-A	Zum Halten und Drehen der Bildgebungskammer auf dem Mikroskoptisch
Motorisierter Z-Deck-Tisch	Vorherige	wissenschaftliche ZDN12MP	Mikroskoptisch, der Probe und Mikromanipulator mit Fluid-Jet-Nadel zusammen halten und bewegen kann
Z-Deck-Tischeinsatzadapter	NIH Maschinenwerkstatt	kundenspezifisch	Zum Anbringen des Kreiskammeradapters auf dem Z-Deck-Tisch
Fluid-Jet-Gerät	ALA scientific instruments	HSPC-1 Hochgeschwindigkeits-Druckklemme mit PV-PUMPE	Zur Steuerung und Abgabe des Fluid-Jet-Stimulus
Masterflex Peroxid-gehärteter Silikonschlauch (1 ft)	Cole-Palmer	Masterflex L/S 13, 96400-13	Zum Anschluss des Fluid-Jet-Nadelhalters an die Druckpumpe
Motorisierter Mikromanipulator	Sutter Instrument Company	MP-225	Zum Halten und Positionieren des Nadelhalters für Flüssigkeit
jet Mikromanipulator Controller	Sutter Instrument Company	MPC-200	Zur Steuerung von Fluidstrahl-Nadelmanipulatoren
Gel-Ladespitzen	Eppendorf	5242956003	Zum Hinterfüllen von Fluidstrahlnadeln Glaskapillar
-/Nadelhalter	WPI	MPH315	Zum Halten von Fluidstrahlnadeln
PSI Manometer	Sper Scientific	840081	Zum Messen Druckzangenausgang
Prism7	Graphpad	Prism7	Software zum Plotten von GCaMP6-Intensitätsänderungen
FIJI	Schindelin, et., al.34<	a href='https://fiji.sc/'>https://fiji.sc/	Software zum Verarbeiten von Bildern und Erstellen von räumlich-zeitlichen Signalkarten
Turboreg Plugin	Thévenaz et., al.29	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/	Plugin zur Registrierung von GCaMP6-Bildsequenzen in FIJI
StackReg Plugin	Thévenaz et., al.29	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/	Plugin zur Registrierung von GCaMP6-Bildsequenzen in FIJI
Times Series Analyzer V3 Plugin	Balaji J 2007, Abt. für Neurobiologie, UCLA	a href='https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html'>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html	Plugin zum Erstellen mehrerer ROIs zur Messung von GCaMP6-Intensitätsänderungen

von Herzinjektionsnadeln <