$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Kommission für ethische Überprüfung der Tiere überprüft und genehmigt.
1. Vorbereitung
1. Toupieren Sie jeden Muskel in kleinen Faserbündeln von etwa 1 mm Breite mit zwei feinen gezackten Pinzetten.
HINWEIS: Es ist entscheidend, die Muskeln sehr sanft mit der Pinzette zu manipulieren, ohne übermäßige Kraft, um Gewebeschäden während des Neckens zu vermeiden.
1. Dissoziieren Sie den Musculus tibialis anterior (TA) je nach Größe in 3 oder 4 Bündel.
2. Bei Gastrocnemius (GA) trenne den medialen und lateralen Teil des Muskels und dissoziiere dann jeden Teil in 4-5 Bündel, abhängig von ihrer Größe.
2. Immunfärbung
1. Fahren Sie mit der Permeabilisierung der Muskelfasern fort: Übertragen Sie die Muskelbündel in 24-Well-Platten, die 1 % (v/v) Triton X-100 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) enthalten, und halten Sie sie 1 h bei RT oder 5 h bei 4 °C unter sanftem Rühren (50 U/min).
HINWEIS: Teilen Sie die Muskelbündel auf zwei Platten auf, um mit getrennten Immunfärbungen fortzufahren und das Risiko einer Antikörperverwechslung zu minimieren. Teilen Sie sie nicht in mehr als zwei Vertiefungen (1 Vertiefung/Platte) auf; Andernfalls kann die Anzahl (N) der neuromuskulären Verbindungen (NMJs), die für ihren allgemeinen Status im analysierten Muskel repräsentativ sind, unzureichend sein.
2. Waschen Sie die Proben 3x für 5 min mit PBS bei RT und inkubieren Sie sie mit einer Blockierungslösung bestehend aus 4% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS/Triton X-100 1% für 4 Stunden bei 4 °C, unter sanftem Rühren (50 U/min).
HINWEIS: Verwenden Sie während der Waschschritte keine Aspirationspumpe, sondern saugen Sie die Lösung manuell mit einer 200 μL-Pipette und kleinen Spitzen ab (die Referenz ist in der Materialtabelle angegeben).
3. Inkubieren Sie die Proben über Nacht (O/N) bei 4 °C unter leichtem Rühren (50 U/min) mit der in Schritt 2.2 angegebenen Blockierungslösung, die primäre monoklonale Antikörper entweder gegen Neurofilament M (NF-M, 2H3, Verdünnung 1/200) oder synaptisches Vesikel-Glykoprotein 2 (SV2, Verdünnung 1/200) enthält, um präsynaptische Axonendigungen bzw. aktive Zonen zu markieren.
4. Am nächsten Tag wasche die Muskelbündel 3x für 5 min in PBS unter Bewegung (50 U/min).
1. Für die konfokale Bildgebung: Inkubieren Sie die Muskelbündel mit sekundären Anti-Maus-Antikörpern, konjugiert mit einem rot emittierenden Fluorophor (F594) (Verdünnung 1/500) und α-Bungarotoxin, konjugiert mit einem grün emittierenden Fluorophor (α-BTX-F488) (Verdünnung 1/1000) in PBS für 2 h bei RT unter Bewegung (50 U/min).
2. Für die Bildgebung mit stimulierter Emissionsverarmung (STED): Inkubieren Sie die Muskelbündel mit sekundären Anti-Maus-Antikörpern, konjugiert mit einem grün emittierenden Fluorophor (F488) (Verdünnung 1/500) und α-Bungarotoxin, konjugiert mit einem dunkelrot emittierenden Fluorophor, das sich durch hohe Photostabilität auszeichnet (α-BTX-F633) (Verdünnung 1/1000) in PBS für 2 h bei RT unter Bewegung (50 U/min).
HINWEIS: Setzen Sie die Proben während der Inkubation keinem Licht aus, um Photobleaching zu vermeiden.
5. Waschen Sie die beschrifteten Muskelbündel 3x für 5 min mit PBS unter Bewegung (50 U/min) und legen Sie sie mit einem Eindeckmedium auf einen Objektträger.
HINWEIS: Platzieren Sie maximal 4 bis 5 Muskelbündel pro Folie, um das Versiegeln zu ermöglichen.
6. Fügen Sie oben ein Deckglas der Güteklasse #1.5 (oder #1.5H) (0.17 mm Dicke) hinzu und platzieren Sie zylindrische Magnete auf beiden Seiten des Objektträgers, um Druck auszuüben und die Muskeln abzuflachen.
7. Halten Sie die Objektträger vor Licht-O/N bei 4°C geschützt. Versiegeln Sie die Objektträger dauerhaft mit Nagellack.
3. Bildaufnahme
1. Aufnahmen mit einem konfokalen Mikroskop
HINWEIS: Die Bilder wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop unter Verwendung eines Ölimmersionsobjektivs mit 63-facher Größe (HCX Plan Apo CS, 1,4 numerische Apertur (NA)) aufgenommen.
1. Für die verblindete Analyse lassen Sie eine Person, die nicht an der Analyse beteiligt ist, jede Folie mit einer bestimmten Nummer codieren. Bleiben Sie für die Versuchsgruppen verblindet, bis die Quantifizierung der NMJ-Parameter für alle Proben abgeschlossen ist.
2. Starten Sie die Mikroskopsoftware im Konfigurationsmodus > >machine.xlhw.
3. Lege den Objektträger auf den Mikroskoptisch und finde die Betrachtungsebene innerhalb der Probe, indem du unter der DAPI-Weitfeld-Fluoreszenzbeleuchtung mit dem DAPI-Filterset schaust.
4.Klicken Sie auf Projekt öffnen > Neue Projekte> und erstellen Sie einen Ordner zum Speichern von Bildaufnahmen.
HINWEIS: Erstellen Sie für jedes NMJ ein neues Projekt, um die Ordnergröße zu begrenzen und Speicherprobleme auf dem Computer zu vermeiden.
5. Um die Erfassungsparameter zu verwalten, klicken Sie auf das Erfassungs-Tab-Fenster und stellen Sie die konfokale Lochblende auf 1,0 Airy-Einheit und Laserleistung ein, um die Verstärkungs- und Offset-Pegel für die grüne/F488 (α-BTX) Fluoreszenz mit einem 488 nm Laser an der Endplatte, der abgebildet werden muss (Live-Modus EIN), zu optimieren.
6. Optimieren Sie als nächstes die Fluoreszenzerfassung von Rot/F594 (NF-M oder SV2) mit einem Laser, der an die F594-Beobachtung angepasst ist. In dieser Studie wurde ein 552 nm Laser (Live Mode ON) verwendet. Stellen Sie das Spektrum der Farbstoffemission für jeden Laser mit den folgenden Bereichen ein: Laser 405 (DAPI) von 414 bis 483 nm, Laser 488 (F488-α-BTX) von 506-531 nm und Laser 552 (NFM/ SV2) von 622-650 nm.
7. Sammeln Sie Bildstapel von neuromuskulären Verbindungen in jeder Versuchsgruppe mit den gleichen Einstellungen: Bildgröße 1024 x 1024 Pixel (73,7 x 73,7 μm) bei 400 Hz Abtastrate, bidirektionales X EIN, Zoomfaktor 2,5, Z-Schrittgröße 0,5 μm im Z-Wide-Modus.
HINWEIS: Für jedes NMJ wird die Anzahl der Schichten so eingestellt, dass die gesamte Verbindung erfasst wird. Die oben beschriebenen Erfassungseinstellungen erfüllen das Nyquist-Shanon-Sampling-Theorem. Der Benutzer kann jedoch auf die Schaltfläche "Format optimieren" klicken, die in allen neueren konfokalen Betriebssoftwares vorhanden ist, um sicherzustellen, dass die Pixelgröße und der Z-Schritt der idealen Nyquist-Abtastrate entsprechen. Dadurch werden Bilder mit Über- oder Unterabtastung vermieden, was zu einem Genauigkeitsverlust bei Volumenmessungen führt.
8. Speichern Sie die Originaldatei (.lif) oder Z-Stapelbilder (.tif) in einem Ordner mit einem Namen, der den Codenamen des Objektträgers, den Färbetyp und die Endplattennummer enthält.
HINWEIS: Sammeln Sie die Scans nacheinander (nicht gleichzeitig) mit den 488 nm und 552 nm Lasern (F488 und F594), um ein Übersprechen der F488-Fluoreszenz in den F594-Kanal und umgekehrt (Durchbluten) zu vermeiden. Der Strahlengang kann mit dem Farbstoffassistenten in der Mikroskopsoftware konfiguriert werden.
9. Wechsle zur nächsten codierten Folie und wiederhole die Schritte 3.1.3-3.1.8 für jedes NMJ.
10. Klicken Sie am Ende der Sitzung auf Im 3D-Viewer öffnen und wählen Sie einen NMJ-Vertreter einer experimentellen Gruppe aus, um die 3D-Beschriftung zu visualisieren.
HINWEIS: Dieser Ansichtsmodus hilft zu überprüfen, ob die Erfassungsparameter korrekt waren.
11. Schließen Sie die Mikroskopsoftware, reinigen Sie die Objektive mit Linsentüchern und schalten Sie dann das System aus.
2. Aufnahmen durch STED-Mikroskopie
HINWEIS: Die Bilder wurden mit einem inversen konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommen, das mit Gated STED bei 775 nm unter Verwendung eines 100-fachen Ölimmersionsobjektivs (HC PL APO CS2 1.4 NA) ausgestattet war.
1. Für die verblindete Analyse lassen Sie eine Person, die nicht an der Analyse beteiligt ist, jede Folie mit einer bestimmten Nummer codieren. Bleiben Sie für die Versuchsgruppen verblindet, bis die Quantifizierung der NMJ-Parameter für alle Proben abgeschlossen ist.
2. Starten Sie die Mikroskop-Software im Konfigurationsmodus > machine.xlhw und STED ON.
3. Klicken Sie auf Projekt öffnen > Neue Projekte, um einen Ordner zum Speichern von Bildaufnahmen zu erstellen.
>HINWEIS: Generieren Sie für jede Folie einen neuen Ordner, um die Ordnergröße zu begrenzen und Speicherprobleme auf dem Computer zu vermeiden.
4. Lege den Objektträger auf den Mikroskoptisch und betrachte ihn unter Weitfeld-Fluoreszenzbeleuchtung mit dem 488 nm Laser, um die Beobachtungsebene innerhalb der Probe zu finden.
5. Suche nach einem NMJ, das mit Neurofilament M (NFM) oder SV2-Färbung markiert ist, indem du den 488-nm-Laser mit einer spektralen Detektion von 506-531 nm verwendest.
6. Wenn ein NMJ identifiziert wurde, klicken Sie auf STED aktivieren und beginnen Sie mit der Aufnahme von Bildern in einem Bereich, der mehrere Verbindungsfalten enthält, mit dem 635 nm Laser mit einer spektralen Detektion von 640-750 nm.
>HINWEIS: Achten Sie während der Bildaufnahme auf die Sättigungsnachschlagetabelle und klicken Sie auf die Schaltfläche Quick LUT, um eine Überbelichtung zu vermeiden (Grauwerte >255; für 8 Bit).
7. Sammeln Sie die Bilder jeder Versuchsgruppe mit den gleichen Einstellungen: Bildgröße 2048 x 2048 Pixel (38,75 x 38,75 μm) bei einer Abtastrate von 400 Hz.
HINWEIS: Die Leistung des Verarmungslasers (STED) ist auf 65% eingestellt.
8. Speichern Sie die Bilder mit einem Dateinamen, der den Code der Folie enthält.
HINWEIS: Es ist möglich, auf Optimiertes XY-Format: Format einstellen zu klicken, um die beste Aufnahmeeinstellung mit STED-Bildgebung zu erhalten.
9. Wechsle zur nächsten codierten Folie und wiederhole die Schritte 3.2.3-3.2.8. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Folien.
10. Am Ende der STED-Mikroskopiesitzung übertragen Sie die Bilddateien auf einen anderen Computer und speichern die Originaldateien (.lif) auf einem externen Laufwerk oder Server.
11. Schalten Sie die Mikroskopsoftware aus, reinigen Sie die Objektive mit Linsentüchern und schalten Sie dann das System aus.