Abgabe eines Fluoreszenzfarbstoffs in den subretinalen Raum einer Maus

Zusammenfassung

Quelle: Parikh, S., et al. Eine alternative und validierte Injektionsmethode für den Zugang zum subretinalen Raum über einen transkleralen posterioren Zugang. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Verabreichung eines Fluoreszenzfarbstoffs in den subretinalen Raum einer Maus. Der Prozess umfasst die Betäubung der Maus, die Vorbereitung des Auges, präzise Schnitte, um Zugang zum subretinalen Raum zu erhalten, und die Injektion des Farbstoffs, um eine kontrollierte Netzhautablösung zu erzeugen. Diese Technik ermöglicht eine gezielte Abgabe des Farbstoffs und ermöglicht so eine detaillierte Bildgebung und Analyse von Netzhautstrukturen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

Tiere: Wildtyp-Mäuse vom Typ C57Bl/6J, gezüchtet an der University of California in Los Angeles (UCLA). Alle Tiere waren zwischen 11 und 17 Wochen alt und umfassten männliche und weibliche Mäuse. Alle Mäuse wurden in Gruppen untergebracht und in einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12:12 mit Futter und Wasser ad libitum gehalten.

HINWEIS: Alle Medikamente und injizierbaren Mittel sind USP-Qualität (United States Pharmacopeia).

1. Chirurgische Vorbereitung

1. Anästhesieren Sie die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von 100 mg/kg Ketamin und 8 mg/kg Xylazin in einer Kochsalzlösungsmischung. Verabreichen Sie die Anästhesie so tief, dass die Maus keine Zehenklemme oder Hornhautberührungsreflexe hat.
2. Halten Sie die Körpertemperatur mit einem zirkulierenden Wasserkissen auf 37,0 °C.
3. Erweitern Sie die Pupillen mit Augentropfen aus 2,5 % Phenylephrin und trimmen Sie die Schnurrhaare, um die Visualisierung zu erleichtern. Schnurrhaare liefern der Maus einen signifikanten sensorischen Input; Daher sollte beim Schnurrhaarschnitt nur der Teil entfernt werden, der den freien Zugang zum Auge blockiert, und nicht zum Ansatz des Schnurrhaars. Unserer Erfahrung nach zeigen Mäuse nach diesem Eingriff eine normale Erholung. Tragen Sie Methylcellulose-Augentropfen auf, um Trockenheit zu verhindern und anästhesieinduzierte vorübergehende Katarakte zu minimieren.
4. Sterilisieren Sie Instrumente vor der Operation (z. B. Betadin und Ethanol oder heiße Kügelchen).
5. Bereiten Sie verdünntes Fluorescein (0,01 % unter Verwendung von 0,9 % Kochsalzlösung) in einer sterilen Umgebung (d. h. in einer Biosicherheitswerkbank) vor, wenn eine Visualisierung durchgeführt wird (siehe Abschnitt 3 unten).

2. Vorbereitung der Injektionsstelle

1. Bereiten Sie eine Spritze (z. B. 5 μl Spritze) mit dem entsprechenden Injektionsvolumen (z. B. 0,3 bis 1,0 μl) vor.
2. Positionieren Sie die Maus so, dass das Auge nach oben zeigt und im Präpariermikroskop gut sichtbar ist.
3. Kneifen Sie die Schläfenbindehaut vorsichtig mit einer Pinzette mit feiner Spitze zusammen. Machen Sie mit einer gebogenen Vannas-Schere einen Umfangsschnitt von ca. 90 Grad.
4. Wiederholen Sie Schritt 2.3 mit der darunter liegenden Zapfenkapsel.
5. Sezieren Sie das umgebende Bindegewebe mit einer feinen Pinzette, während Sie den Globus nasal drehen. Arbeiten Sie sich in Richtung der Injektionsstelle etwa 0,5 mm temporal zum Sehnerv vor. Seien Sie sehr vorsichtig, um eine Störung des retroorbitalen Sinus zu vermeiden.

3. Sklerotomie und subretinale Injektion

HINWEIS: Es wird empfohlen, die Injektion von 0,01 % Fluorescein in 0,9 % Kochsalzlösung zu verwenden, um die Visualisierung beim Erlernen dieses Verfahrens zu unterstützen. Die topographische Verteilung von Fluorescein kann mit Fundusbildgebung effektiv dokumentiert werden (siehe Abschnitt 4 unten).

1. Machen Sie einen kleinen Skleralschnitt an der Injektionsstelle, indem Sie die Augenmuschel vorsichtig mit einer 22,5 Grad starken Augenklinge zerkratzen. Dieser Schnitt sollte nur groß genug sein, damit die Nadelspitze durch die Sklera hindurchdringen kann.
2. Führen Sie die abgeschrägte 33 G Nadel (5 - 10° abgewinkelt) mit der Abschrägung nach oben und schräg zur Netzhaut in die Sklelotomie ein. Injizieren Sie das gewünschte Volumen (z. B. 0,3 bis 1,0 μl 0,01 % Fluorescein zu Lernzwecken).
   HINWEIS: Halten Sie die Sterilität der Spritze aufrecht, indem Sie sie vor jeder Injektion gründlich mit einem geeigneten Lösungsmittel und DI-Wasser waschen.
3. Drücken Sie den Kolben langsam (über ~ 3 Sekunden), ohne die Nadel zu bewegen und mit gleichmäßigem Druck.
   HINWEIS: Wenn sich die Nadel im subretinalen Raum befindet, ist beim Drücken des Kolbens ein leichter Widerstand zu spüren. Es gibt keinen bis minimalen Widerstand, wenn die Nadel die Netzhaut durchsticht, und einen hohen Widerstand, wenn die Nadel nicht in die Sklera oder das retinale Pigmentepithel (RPE) eindringt.
4. Warten Sie einige Sekunden, bevor Sie die Nadel zurückziehen, um den Rückfluss zu minimieren.
5. Spülen Sie das Auge mit steriler gepufferter Kochsalzlösung und stellen Sie sicher, dass sich das Auge wieder in seine normale Position gedreht hat.

4. Beurteilung der Netzhautablösung durch optische Kohärenztomographie (OCT) und Fundusbildgebung

1. Führen Sie unmittelbar nach der Injektion eine OCT-Bildgebung durch, um die Qualität der Injektion zu beurteilen, und zu geeigneten Zeitpunkten nach der Injektion, um die Netzhautstruktur zu beurteilen.
   1. Passen Sie das OCT-Bild an und richten Sie es so aus, dass es auf die Injektionsstelle abzielt. Die Injektionsstelle sollte sich in der Mittellinie und 0,5 mm temporal zum Sehnervenkopf befinden. Wiederholen Sie dies bei Bedarf, wenn die Ablösung außerhalb des Rahmens oder nicht optimal zentriert ist.
2. Visualisieren Sie die Netzhautablösung und den Farbstoffinjektionsbereich mit en-face Fundusbildgebung.
   HINWEIS: Wenn kein OCT-Bildgebungssystem verfügbar ist, ermöglicht die Injektion einer kleinen Menge Fluorescein mit einem Vektor für die Praxis die Visualisierung mit jeder Funduskamera, die eine Fluoreszenzangiographie mit den gleichen Anregungswellenlängen und Blockierungsfiltern durchführt. Unter dem Gefäßsystem treten lokalisierte Bereiche mit Hyperfluoreszenz auf, und das Gefäßsystem hat scharfe und deutliche Grenzen, wenn der subretinale Raum richtig anvisiert wird. Der Rand der Blase von der Injektion wird durch den Übergang von Hyper- zu Hypofluoreszenz abgegrenzt. Mehrere Instrumente bieten diese Fähigkeit für die Maus; Die hier verwendete Instrumentierung wird an anderer Stelle beschrieben.

5. Postoperative Pflege:

1. Tragen Sie eine dicke Schicht dreifacher antibiotischer Augencreme auf die Hornhautoberfläche des injizierten Auges auf.
2. Setzen Sie Mäuse zur Genesung in saubere Einzelkäfige. Kombinieren Sie Mäuse, die operiert wurden, nicht, bis sie sich vollständig erholt haben.
3. Überwachen Sie die Atmung und Temperatur während der Wiederherstellung der Anästhesie. Überwachen Sie die Tiere, bis sie das Brustbein aufrecht erhalten können.
4. Führen Sie zusätzliche geeignete postoperative Überwachungen und Behandlungen durch, einschließlich einer subkutanen Injektion von Carprofen (5 mg/kg) zur postoperativen Schmerzbehandlung.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Spritze x 1
Hamilton Nadel 33 G, 1.0", 20 Grad, Spitze 3 (Edelstahl 304)	Hamilton	7803-05	Nadeln x 6
Vannas Gebogene Schere	Ted Pella, INC.	1347	5 mm Klinge
22,5 Grad Mikrochirurgie-Messer	Wilson Ophthalmic Corp.	91204
Ketaject	Phoenix	NDC 57319-609-02	Ketamin
Anased	Lloyd Laboratories	NDC 61311-482-10	Xylazin
Fluorescein 10% AK-Fluor	Akorn	NDC 17478-253-10 100	mg/ml
0,9% Kochsalzlösung USP	Hospira	NDC 0409-4888-50	0,9% NaCl
Antibiotische Salbe	Akorn	NDC 17478-235-35	Ophthalmische
Wasserumwälzpumpe	Gaymar	TP-500 T/Pumpe	P/N 07999-000
SD-OCT	Bioptigen	R-Series	Kommerzielle
Funduskamera	Phoenix Research Laboratories	MICRON III
Pinzette Typ 3	Ted Pella, INC.	5385-3SU
2,5% Phenylephrin	Paragon BioTeck	NDC 42702-102-15	Ophthalmic
Hypromellose 2,5%	Goniovisc	AX0401	Methylcellulose
Augentropfen (Spülung)	Bausch & Lomb		Kochsalzlösung
Mikroskop	Zeiss	Stemi 2000	Mikroskop
Lichtquelle	Fostec	P/N 20520	Lichtquelle