High-Throughput-Assay Verzuckerung für Lignocellulose-Materialien

Zusammenfassung

Eine einfache, schnelle Methode zur Bestimmung der Verzuckerung Potenzial einer großen Zahl von pflanzlicher Biomasse Proben beschrieben. Die automatisierte Plattform für diese Analyse umfasst die Vorbereitung der pflanzlichen Biomasse für die Analyse in 96-Well-Platten und die anschließende Performance der Vorbehandlung, Hydrolyse und Quantifizierung der Zucker freigesetzt.

Zusammenfassung

Polysaccharide, aus denen sich Pflanzen Lignozellulose aufgeschlüsselt werden können, um eine Reihe von Zuckern, die später bei der Errichtung einer Bioraffinerie eingesetzt werden können produzieren. Diese Rohstoffe wäre eine neue industrielle Plattform, die sowohl nachhaltig als auch klimaneutral ist, um die derzeitige Abhängigkeit von fossilen Brennstoffen zu ersetzen. Die Widerspenstigkeit der Dekonstruktion in Lignocellulose-Materialien beobachtet wird von mehreren intrinsischen Eigenschaften der pflanzlichen Zellwände produziert. Kristalliner Cellulose ist in Matrix-Polysaccharide wie Xylane und Arabinoxylane eingebettet, und die ganze Struktur ist umhüllt von der phenolischen Polymer Lignin, das ist auch schwierig zu ¹ zu verdauen. Um die Verdaulichkeit von pflanzlichen Materialien, die wir benötigen, um die wichtigsten Engpässe für die Verzuckerung der Zellwände und auch Bildschirm-Mutante und Populationen zu entdecken, um die Variabilität in Verzuckerung ² auszuwerten verbessern. Diese Aufgaben erfordern einen hohen Durchsatz Ansatz und hier präsentieren wir eine analytische Plattform, die Verzuckerung Analyse in einer 96-Well-Platte-Format durchführen können. Diese Plattform wurde entwickelt, um das Screening von Lignocellulose Verdaulichkeit von großen Populationen von verschiedensten Pflanzenarten ermöglichen. Wir haben den Reaktionsvolumina für die schonende Vorbehandlung, partielle enzymatische Hydrolyse und Zuckerbestimmung skaliert, damit eine große Zahl schnell in ein automatisiertes System beurteilt werden.

Diese vollautomatische Plattform arbeitet mit Milligramm-Mengen von Biomasse, die Durchführung Kugelmühle unter kontrollierten Bedingungen, um die pflanzlichen Materialien zu einem standardisierten Partikelgröße in reproduzierbarer Weise zu reduzieren. Sobald die Proben Boden sind, verzichtet die automatisierte Formatierung Roboter angegeben und erfasst Mengen an Material in die entsprechenden Vertiefungen der 96-well-Platte (Abbildung 1). Normalerweise verzichten wir aus dem gleichen Material in 4 Vertiefungen zu haben 4 Wiederholungen für die Analyse. Sobald die Platten mit dem Pflanzenmaterial in das gewünschte Layout gefüllt sind, werden sie manuell in einen Liquid-Handling-Station (Abbildung 2) bewegt. In dieser Station werden die Proben auf eine milde Vorbehandlung entweder mit verdünnter Säure oder alkalischen unterzogen und über Nacht bei Temperaturen von bis zu 90 ° C. Die Vorbehandlung Lösung wird anschließend entfernt und die Proben werden mit Puffer gespült, um sie zu einem geeigneten pH-Wert für die Hydrolyse zurückzukehren. Die Proben werden dann mit einem Enzym-Gemisch für eine variable Länge der Zeit bei 50 ° C inkubiert Ein Aliquot wird aus dem Hydrolysat entnommen und der reduzierenden Zucker werden automatisch von der MBTH kolorimetrischen Methode bestimmt.

Protokoll

1. Vorbereitung der Proben

Wir normal arbeiten mit Stielen entweder krautige oder holzige Pflanzen. Im Falle von krautigen Materialien, die wir wachsen die Pflanzen zur Reife, und nach Samenentwicklung wir sammeln trockenen Stängel einmal Seneszenz ist abgeschlossen. Die Stiele sind in 4 mm Segmente geschnitten und in 2 ml Fläschchen mit drei Mahlkugeln. Im Falle von holzigen Stoffen, sind die Proben zu groben Sägemehl mit einem Kurs Holz-Datei Boden und dann in einer Kugelmühle für die weitere Verarbeitung.

Die Proben werden in einem Rack im Schleifen / Formatierung Station (Abbildung 1) platziert. Diese Station sequenziell mahlt, mischt und wiegt jede Probe. Die Anzahl der Wiederholungen pro Probe notwendig ist durch die Prüfung das Mahlgut in einer Reihe von Vorversuchen, wo die intrinsische Variabilität für eine bestimmte Partikelgröße bestimmt wird gegründet. Die 2 ml-Fläschchen sind an der Unterseite durchbohrt und die Materialien werden durch Vibration des Fläschchens über den gewählten gut verzichtet. Die vibrierende Arm wird durch ein Feedback aus der Bilanz unter Berücksichtigung der genaue Dosierung des Pulvers gesteuert. Der Roboter verzichtet 4 mg / well in einer Standard-Analyse und 4 Wiederholungen sind in den meisten Fällen erforderlich. Dies erlaubt 20 Pflanzenproben / Platte analysiert werden.

2. Vorbehandlung

Sobald die Proben formatiert sind, werden die 96-Well-Platten durch eine automatisierte Liquid-Handling-System (Abbildung 2) verarbeitet. Hier eine milde Vorbehandlung ist auf die pflanzlichen Materialien durch Zugabe von 350 ul von sauren oder alkalischen Lösungen und Erhitzen der Platte auf eine angepasste Block durchgeführt. Zur Vermeidung von Verdunstung während der Analyse sind die 96-Well-Platten mit einer Silikon-matt versiegelt. Die Temperatur und der Zeit der Vorbehandlung kann nach den Materialien untersucht geändert werden. Die maximale Temperatur, jedoch beträgt 100 ° C. Ein alternatives Verfahren zur Prüfung von härteren Vorbehandlungen ist es, die Materialien off line Vorbehandlung und die Beseitigung der pretreatmet aus dem Prozess.

3. Hydrolyse

1. Nach den Materialien vorbehandelt werden, der Roboter automatisch entfernt die Vorbehandlung Lösung und wäscht, alle Brunnen, 5-mal mit 850 ul 25 mM Acetatpuffer. Die Spülungen werden durch Zugabe von Puffer, um die Vorbehandlung Lösung und anschließendem Entfernen 50% des Gesamtvolumens nach Abzug der Feststoffe in der Probe zu begleichen durchgeführt. Die Höhe der Anspruch ist bei der Hälfte der flüssigen Masse zu vermeiden Absaugen von Feststoffen aus dem Grund des Brunnens gesetzt, es gibt vernachlässigbaren Verlust von Festkörpern mit Hilfe dieses Ansatzes. Nach diesen wäscht die pH-Wert im gut 4,5 und das Material ist bereit für die enzymatische Hydrolyse.
2. Ein Enzym-Gemisch mit einer Lösung von Cellulasen und Hemicellulasen wird vom Roboter aufgenommen. In jede Vertiefung, ist 850 ul der Enzymmischung verzichtet und die Platte wird in einem 50 ° C Schüttelinkubator verschoben. Die Standard-Hydrolyse ist für 8 h durchgeführt, aber diesmal können, um den Zweck des Experiments angepasst werden. Die Standard-Enzymbeladung für Gräser eingesetzt ist 7 FPU / g Material.

4. Nachweis von reduzierenden Zuckern

Bestimmung von reduzierenden Zuckern nach Hydrolyse freigesetzt wurde durchgeführt unter Verwendung eines modifizierten 3-methyl-2-benzothiazolinon Hydrozone (MTBH) Methode ^3. MBTH wurde als das am besten geeignete Methode ausgewählt, weil es am einfachsten zu automatisieren und die am wenigsten anfällig für Störungen durch Verbindungen wie Proteine ​​wurde. Wir modifizierten diese hochempfindliche Methode für den Einsatz auf der Roboter-Plattform, so dass es genau quantifizieren könnten Zucker in den Konzentrationen in der Biomasse-Hydrolysate, mit einem Gesamtvolumen von 250 ul, die für eine herkömmliche optische 96-Well-Platte ist. Alle folgenden Schritte werden automatisch durchgeführt von drei unabhängigen Bestimmungen der reduzierenden Zucker wurden für jedes Verzuckerung Reaktion durchgeführt.

1. 30 ul Hydrolysat wurde aus dem tiefen Loch-Platte aufgenommen und mit 45 ul 25 mM Natriumacetat-Puffer in einem skirted PCR 96-Well-Platte.
2. 25 ul 1N NaOH und 50 ul einer Lösung mit 0,43 mg / ml MBTH und 0,14 mg / ml DTT wurden hinzugefügt.
3. Nach dem Mischen wurde die PCR-Platte bei 60 ° C für 20 min in einem Thermocycler oder ein ähnliches Gerät, das genau die gleiche Menge an Wärme liefert, um alle 96 Wells.
4. Die daraus resultierende Reaktion auf eine optische Platte übertragen.
5. 100 l von oxidierenden Reagenz (0,2% FeNH4 (SO4) 2, 0,2% Amidosulfonsäure und 0,1% HCl). Gut mischen und zu entwickeln für mindestens 1 h
6. Jede Platte sollte auch Standard-Reaktionen von 50 nmol, 100 nmol und 150 nmol Glukose. Die optische Platten werden bei 620 nm gelesen.

5. Repräsentative Ergebnisse:

Beispiele für verschiedene Arten von Analysen sind in Abbildung 3 und 4 dargestellt. Alle Ergebnisse wurden mit Hilfe der automatisierten Plattform erhalten. Abbildung 3 restellt die Zunahme der reduzierenden Zuckern von 8 h Inkubationen vom Boden aus Pappelholz mit steigenden Mengen von cellulolytischen Enzyme freigesetzt. Abbildung 4 zeigt die Auswirkungen des sauren und alkalischen Vorbehandlung auf Pappel Proben. Die NaOH Vorbehandlung ist effizienter, die verdünnte H2SO4 Vorbehandlung bei der Erleichterung der Freisetzung von Zucker bei der Hydrolyse. Die Höhe der Zucker nach der Hydrolyse gemessen abnimmt, wenn die Vorbehandlung durchgeführt wird unter Verwendung von NaOH-Konzentrationen höher als 1M.

Abbildung 1. Robotic-Station für Schleif-und 96-Well-Format von Biomasse

Abbildung 2. Liquid Handling Station für die Hochdurchsatz-Analyse Verzuckerung

Abbildung 3. Einfluss verschiedener Enzym Belastungen auf die Freisetzung von reduzierenden Zuckern Mittel aus Pappel-Proben

Abbildung 4. Auswirkung der unterschiedlichen Vorbehandlungen auf die Verzuckerung der Pappel Proben. A. Zucker nach pretreament mit unterschiedlichen Prozentsätzen von H2SO4 bei 90 ° C für 30 Minuten freigegeben. B. Zucker nach NaOH Vorbehandlungen bei der gleichen Temperatur und Zeit freigesetzt, als die Säure Vorbehandlung .

Diskussion

Variationen des Standard-Verzuckerungsprotokolls können auf derselben Plattform zur Bestimmung der Aktivität zellulolytischer Enzyme verwendet werden (d. h. durch Variation der in einer Platte verwendeten Enzymkonzentrationen sowie unter Verwendung von Papier als Substrat); Vergleich der Wirksamkeit mehrerer Enzymgemische auf einem bestimmten Material; Zeitverlauf für die Verzuckerung; etc.

Ein Standard-Verzuckerungsprotokoll zum Vergleich des Verzuckerungspotenzials in verschiedenen Pflanzenmaterialien beinhaltet eine achtstündige Hydrolyse (Abbildungen 3 und 4). Für die meisten analysierten Pflanzenmaterialien sind vier Wiederholungen erforderlich. Unter diesen Bedingungen kann die Plattform 80 Proben/Tag verarbeiten. Diese Analyse wird verwendet, um große Populationen von Gerste, Mais und Brachypodium zu screenen, um die Variabilität des Verzuckerungspotenzials und der an seiner Bestimmung beteiligten Gene zu ermitteln⁴.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer
Grinding & Wiegen Roboter	Labman Automation
2 ml Mikro-Schlauch mit Kappen	Sarstedt Ltd	72,694
5 mm Edelstahl Perlen	Qiagen Ltd	69989
1.2ml Abgene Platz auch Speicherplatten	Fischer Scientific Ltd	TUL-050-050C
Whatman Deckel für 96 Quadratmeter Well-Platten	Fisher Scientific Ltd	7704-0104
Flüssige Hanling Roboter	Tecan Group Ltd	Freedom Evo 200
Schwefelsäure	Fisher Scientific Ltd	S/9231/PB17
Natriumhydroxid	Fisher Scientific Ltd	BPE359-500
Natriumacetat	Sigma-Aldrich	S8750-500G
Essigsäure	Fisher Scientific Ltd	A/0420/PB17
Novozyme 188	Novozyme	DCN00214
Celluclast 1.5L	Novozyme	CCN03122
96-Well-PCR vollen Rock Platten	Sarstedt Ltd	72.1980.202
D-Glucose	Fisher Scientific Ltd	G/0450/53
3-Methyl-2-benzothiazolinon Hydrazon Hydrochlorid Hydrat	Sigma-Aldrich	129739-25G
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D9163-1G
Corning Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden	Fisher Scientific Ltd	TKT-521-050H
Ammoniumeisen (III)-Sulfat Dodecahydrat	Sigma-Aldrich	F1668-250G
Sulfaminsäure	Sigma-Aldrich	242772-500G
Salzsäure	Fisher Scientific Ltd	12462-0026