In-vivo-Bildgebung des Liquortransports in einem Mäusegehirn mittels Fluoreszenzmakroskopie

Zusammenfassung

Quelle: Sweeney, A. M., et al. In vivo Bildgebung des Liquortransports durch den intakten Schädel der Maus mittels Fluoreszenzmakroskopie. (2019)

Dieses Video zeigt den Prozess der Visualisierung des Liquorflusses (CSF) in einem Mäusegehirn mithilfe von Fluoreszenzbildgebung. Ein fluoreszierender Tracer wird in die Cisterna magna (CM) injiziert, so dass ihre Bewegung mit dem Liquor durch den Subarachnoidal- und perivaskulären Raum verfolgt werden kann. Die Zeitrafferbildgebung erfasst die Reise des Tracers und zeigt seine Verteilung im Hirngewebe über die Arteriolen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Vorbereitung der Cisterna Magna Kanüle, der Kopfplatte und des Kopfhalters

1. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente und Kopfplatten vor der Operation.
   HINWEIS: Fluoreszierende Tracer werden über eine Cisterna magna Kanüle direkt in den Liquor eingebracht.
2. Brechen Sie mit einem Nadeltreiber kurz die Spitze einer 30G x 12,7 mm (1/2 Zoll) Nadel zu 3/4 nach unten und stecken Sie das stumpfe Ende der Nadel in ein Ende eines Schlauchs aus Polyethylen 10 (PE10) (ca. 45 cm lang). Achten Sie darauf, dass nur die Fase aus dem Rand des PE10-Schlauchs herausragt.
3. Brechen Sie 1/4 des abgeschrägten Endes einer weiteren 30G-Nadel ab und stecken Sie das stumpfe Ende der restlichen Nadel in das andere Ende des PE10-Schlauchs, wobei der Luer-Lock aus Kunststoff noch angebracht ist.
4. Füllen Sie eine 100-μl-Glasspritze mit sterilem, künstlichem Liquor (aCSF: 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 2 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 10 mM Glukose und 26 mM NaHCO₃).
5. Befestigen Sie die Spritze am Ende der Leitung und füllen Sie sie mit aCSF, bis sie die Spitze der abgeschrägten Nadel erreicht. Es ist wichtig, dass die Spritze mit aCSF und nicht mit Luft befüllt wird, da eine Luftsäule anfälliger für variable Infusionsvolumina ist.
6. Lassen Sie bei chronischen Experimenten die Linie mit aCSF gefüllt und überspringen Sie Schritt 1.7.
7. Für akute Experimente setzen Sie die Spritze auf eine Infusionspumpe und ziehen Sie ca. 5 mm Luft ab, um ein Vermischen zu verhindern. Entnehmen Sie anschließend das Gesamtvolumen des Tracers/der Tracer, das für das Experiment gewünscht wird (20 % extra werden aufgrund von Totraumverlusten empfohlen).
   HINWEIS: Der PE10-Schlauch sollte lang genug sein, damit die Luftblase beim Laden des Tracers nicht in die Kunststoffmanschette der Glasspritze eindringt. Für ein typisches Experiment verwendet das Protokoll 10 μl Rinderserumalbumin, konjugiert mit Alexa Fluor 647 (BSA-647), verdünnt in aCSF bei 0,5 %.
8. Vergewissern Sie sich, dass die Kopfplatte in die Kopfhalterung passt und dass sie die richtige Größe für die verwendete Maus hat. Anatomische Markierungen, um dies zu gewährleisten, sind: Der obere Rand des Fensters richtet sich nach der Augenlinie aus und der hintere Rand fällt rostral zum Hinterhauptkamm ab.
   HINWEIS: Kopfplatten aus Edelstahl können sterilisiert und wiederverwendet werden. Die meisten Cyanacrylat-Mischungen können mit einer Acetonlösung entfernt werden.

2. Chirurgischer Eingriff

1. Wiegen und betäuben Sie die Maus (z. B. Ketamin/Xylazin; 100 mg/kg Ketamin, 10 mg/kg Xylazin; i.p.).
2. Sobald die Maus nicht mehr auf ein Zehenklemmen reagiert, befeuchten Sie Hals und Kopf mit sterilem Wasser und rasieren Sie sich mit einer Haarschneidemaschine. Sobald der Bereich rasiert ist, wischen Sie den Bereich erneut mit einem Alkoholtupfer ab, um alle Resthaare zu entfernen.
   HINWEIS: Durch das Befeuchten des Fells vor dem Scheren wird die Menge an Haaren im Bildgebungsfenster nach dem Schnitt drastisch reduziert.
3. Legen Sie die Maus in einen stereotaktischen Rahmen auf ein temperaturgesteuertes Pad und tragen Sie Petroleum-Augensalbe auf die Augen der Maus auf, um sicherzustellen, dass sie nicht austrocknen.
4. Reinigen Sie die exponierte Haut mit einem Chlorhexidin-Tupfer. Entfernen Sie nach 2 Minuten das Chlorhexidin mit einem Alkoholtupfer. Zum Schluss tragen Sie eine Jodlösung auf, die Sie trocknen lassen können.
5. Injizieren Sie eine subkutane Analgesie (0,25 % Bupivacain HCl) in die Oberseite des Schädels und den Hals.
6. Beginnend an dem Teil des Halses, der den Hinterhauptkamm bedeckt, machen Sie einen Schnitt in der Mittellinie in der darüber liegenden Haut und setzen Sie ihn rostral in Richtung Interorbitallinie fort. Seitlich bis zur Grenze einschneiden, an der der Schläfenmuskel in den Schädel eingreift. Entfernen Sie die gesamte Haut des fusiformen Schnittes, um sowohl das Stirn- als auch das Scheitelbein freizulegen.
   VORSICHT: Der Sinus retroorbitalis liegt kaudal zu den Augen und große Äste der hinteren Gesichtsvene liegen rostral zur Ohrmuschel. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie den Schnitt machen, um diese Strukturen zu schonen. In diesem Fall stoppen Sie die Blutung, indem Sie die Blutstillung mit einem sterilen Wattestäbchen einige Minuten lang aufrechterhalten und fortfahren.
7. Spülen Sie den Schädel mit steriler Kochsalzlösung und reinigen Sie die Oberfläche mit Wattestäbchen, so dass sie frei von Ablagerungen und Haaren ist, da diese die Bildqualität beeinträchtigen. Die Schädeltransparenz wird am besten erhalten, indem das Periost und die darüber liegende Faszie intakt bleiben.
   HINWEIS: Wenn diese Strukturen versehentlich entfernt werden, kann der Schädel mit der Zeit trocken und undurchsichtig werden. Befeuchten Sie es erneut mit aCSF oder verwenden Sie eine Mischung aus Paraffinöl und Glycerin, um die Schädelreflexion in akuten Experimenten zu reduzieren.
8. Fahren Sie mit dem Einführen der Cisterna Magna Kanüle fort.
9. Nach dem Einsetzen der CM-Kanüle tragen Sie eine Mischung aus Zahnzement und Cyanacrylatkleber auf die ventrale Seite der Kopfplatte um den Rand herum auf und legen Sie sie so auf den Schädel, dass der vordere Rand der Kopfplatte mit der hinteren Spitze des Nasenknochens und der hintere Rand mit dem vorderen Aspekt des interparietalen Knochens ausgerichtet ist. Dabei ist darauf zu achten, dass die sagittale Naht (Mittellinie) zentriert und relativ zum Fenster gerade ist (Abbildung 1B).
10. Fixiere die Position der Kopfplatte mit ein paar Tropfen Leimbeschleuniger. Füllen Sie alle verbleibenden Lücken mit der Zementmischung und härten Sie sie mit Beschleuniger aus.
    ACHTUNG: Stellen Sie sicher, dass das Cyanacrylat nicht mit den Augen der Maus in Berührung kommt oder das Bildfenster blockiert.
11. Kleben Sie die CM-Kanüle auf die Kopfplatte, um sicherzustellen, dass sich diese beim Transport oder beim Aufwachen der Maus nicht lösen.
12. Für akute Experimente fahren Sie mit Schritt 2.16 fort.
13. Tragen Sie bei chronischen Experimenten eine dünne Schicht klar trocknenden Cyanacrylatkleber auf den freiliegenden Schädel auf und achten Sie darauf, keine Blasen zu bilden, da diese die Bildgebung beeinträchtigen. Der Kleber schützt den Schädel und beeinträchtigt die Bildgebung nicht. Achte darauf, dass der Kleber den freiliegenden Schädel bis zur Haut an der Inzisionsgrenze bedeckt.
14. Halten Sie den mit aCSF gefüllten PE10-Schlauch mit einer Hämostatenklemme 2-3 cm vom CM entfernt und schneiden Sie die Leitung mit einer Hochtemperatur-Kauterspitze ab. Sobald er getrennt ist, drücken Sie den geschmolzenen PE10-Schlauch flach, um die Kanüle abzudichten.
    ACHTUNG: Stellen Sie sicher, dass Sie die Klemme erst nach dem Versiegeln der Kanüle lösen und vergewissern Sie sich, dass der Schlauch keine Lecks aufweist, um eine Liquorfistel zu verhindern.
15. Verabreichen Sie Carprofen (5 mg/kg alle 24 Stunden für 3 Tage; intraperitoneal [i.p.] oder subkutan [s.c.]) und bringen Sie die Maus in einen temperaturkontrollierten, einhausigen Käfig zurück und lassen Sie sie sich vor der Bildgebung mindestens 24 Stunden lang erholen. Lassen Sie die Maus nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um die Brustbeinlage aufrechtzuerhalten. Intakte Schädelfenster bleiben über mehrere Wochen stabil. HINWEIS: Das chronische Experiment kann hier pausiert werden.
    VORSICHT: Einige postoperative Komplikationen sind: Kephalohämatome/subgaleale Hämatome, Liquorfisteln und Infektionen.
16. Setzen Sie die Maus für akute Experimente mit der Kopfplatte in die Kopfhalterung ein, so dass sich der Schädel in einer festen Position befindet. Achten Sie darauf, den Anästhesiegrad zu überprüfen und legen Sie ein Heizkissen unter die Maus. Die Maus ist nun bereit, zum Makroskop gebracht zu werden.
    ACHTUNG: Transportieren Sie die Maus vorsichtig zusammen mit der Infusionspumpe auf einem Wagen. Wenn sich die CM-Kanüle löst, führt dies zu einem Abfall des Hirndrucks und eventuelle Liquorlecks verändern die Versuchsergebnisse.

3. Vorbereiten der Maus für die Bildgebung

HINWEIS: Das Protokoll variiert je nachdem, ob das Bildgebungsexperiment an einer anästhesierten (ab Schritt 3.1) oder wachen (ab Schritt 3.2) Maus durchgeführt wird.

1. Anästhesierte Mäuse
   1. Platzieren Sie den Kopfhalter auf dem Tisch des Makroskops und stellen Sie sicher, dass es keine Knicke in der Leitung von der Spritzenpumpe zur CM-Kanüle gibt und dass er nicht gespannt ist, da dies die Tracer-Infusion beeinträchtigen könnte.
   2. Beobachten Sie die Atemfrequenz und die rosafarbene Färbung der Schleimhäute, was auf eine gute Sauerstoffversorgung hinweist. Injizieren Sie bei Bedarf Kochsalzlösung subkutan, um den Feuchtigkeitsgehalt zu sichern. Vergewissern Sie sich, dass das Tier ausreichend betäubt ist, und dosieren Sie bei Bedarf erneut.
   3. Schalten Sie die Makroskop-Kamera und die Leuchtdiode (LED) ein und starten Sie den LIVE-Modus.
   4. Bestätigen Sie die Vergrößerung des Bildgebungsfeldes, so dass die nasofrontale Naht am oberen Rand des Feldes und die Lambdoidnaht am unteren Rand deutlich sichtbar sind, wobei die sagittale Naht parallel und zentriert zur Bildmitte verläuft (Abbildung 1C). Sobald der Kopfhalter angebracht ist, befestigen Sie ihn mit Klebeband am Makroskoptisch.
   5. Fokussieren Sie das Makroskop auf den freiliegenden Schädel. Obwohl Makroskope eine relativ große Schärfentiefe haben, kann durch die Krümmung des Schädels der Maus nur ein bestimmter Bereich scharf gestellt werden. Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn sich die Brennebene an den lateralen Seiten der Scheitelknochen hinter den koronalen Nähten befindet.
      HINWEIS: Dies ist die Stelle der mittleren Hirnarterien (MCA), an der der größte Liquorzufluss stattfindet (Abbildung 1D, E).
2. Awake Mice
   1. Lassen Sie die Tiere vor der Bildgebung mindestens 24 Stunden lang von der Kopfplattenoperation erholen. Längere Erholungsphasen (5-7 Tage) werden ebenfalls empfohlen. Während dieser Zeit trainieren Sie die Maus so, dass sie für die Dauer der Erholungsphase 0,5-1 h pro Tag mit dem Kopf auf der Bühne im Rückhalterohr fixiert ist.
      HINWEIS: Die Gewöhnung ermöglicht es, die Maus ohne Betäubung an der Kopfhalterung zu befestigen und Stress und Ängste während des eigentlichen Experiments zu reduzieren. Wenn dies nicht möglich ist und die Anästhesie das Experiment nicht beeinträchtigt, kann eine Induktionsdosis eines Inhalationsanästhetikums (z. B. Isofluran 2% bei 1-2 L/min O2-Flussrate) verwendet werden, um die Maus schnell am Kopftisch zu befestigen.
   2. Sobald die Maus an der Kopfhalterung und im Rückhalterohr befestigt ist, befolgen Sie die Schritte 3.1.1 bis 3.1.5.

4. Infusion von fluoreszierenden Liquortracern

1. Akute CM-Kanülierung
   1. Da der Tracer bereits in die Kanüle geladen wurde, bevor er in Schritt 1.6 in die Cisterna magna eingesetzt wurde, stellen Sie die Infusionspumpe auf die gewünschte Rate und das gewünschte Volumen ein. Routinemäßig verwendete Infusionsparadigmen sind 5-10 μl bei 1-2 μl/min, aber diese Parameter können je nach Experiment oder Größe und Alter des Tieres angepasst werden.
2. Chronische CM-Kanülierung
   1. Befolgen Sie vor Beginn der Bildgebungssitzung die Schritte 1.2-1.7 für akute Experimente, um die Infusionsleitung für die Verabreichung der Tracer vorzubereiten.
   2. Sobald die Leitung vorbereitet ist, wird das versiegelte Ende der chronischen CM-Kanüle mit einer Hämostatenklemme durchtrennt. Nehmen Sie die Nadel von der in Schritt 4.2.1 vorbereiteten Leitung und führen Sie sie vorsichtig in die Kanüle ein. Lösen Sie die Klemme und schieben Sie den Liquortracer mit der gewünschten Infusionsrate (z. B. 2 μL/min) für das Experiment vor, bis der Tracer die implantierte Nadel im CM erreicht.
      ACHTUNG: Wenn die Nadel beim Verbinden der Leitung den Schlauch durchsticht, entfernen Sie die Nadel, schneiden Sie das durchstochene Segment ab und wiederholen Sie diesen Schritt. Jeder Riss im PE10-Schlauch führt zu einem Leck und beeinträchtigt die Ergebnisse des Experiments.

5. Einrichten der Bildgebungssitzung

1. Bestimmen Sie auf der Grundlage des zu infundierenden Fluoreszenztracers die Anregungswellenlänge und die Belichtungszeit für jeden Kanal. Wählen Sie die kürzeste Belichtungszeit, die für die Visualisierung des Tracers erforderlich ist, um die zeitliche Auflösung der Zeitrafferaufnahme zu maximieren. Diese Expositionszeit wird für alle nachfolgenden Experimente verwendet, die darauf abzielen, den Liquortransport zwischen verschiedenen Tieren zu vergleichen.
   HINWEIS: Ein Tipp ist, den Tracer in der CM-Linie zu verwenden, um die Expositionszeit einzustellen. Dies ist zwar ein sinnvoller erster Ansatz, sollte aber im Laufe der Zeit optimiert werden.
2. Wählen Sie die Dauer des Experiments und die Intervalle aus, in denen die Bilder aufgenommen werden. Die Experimente dauern in der Regel zwischen 30 und 60 Minuten, je nachdem, welche Phase des glymphatischen Transports von Interesse ist. Bildraten von 1 Bild/min und schneller sind für die meisten Experimente ausreichend.
3. Legen Sie den Dateinamen und das Speicherverzeichnis fest.
4. Wenn die Bildgebung zusätzlich zur gleichzeitigen Erfassung anderer Variablen (z. B. Elektrokardiogramm, arterieller Blutdruck, Elektrophysiologie) erfasst wird, können das Makroskop und die Pumpe so programmiert werden, dass sie mit einer Datenerfassungssoftware ausgelöst werden. Überprüfen Sie, ob die Auslösefunktion am Makroskop korrekt ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.

6. Transkranielles optisches Bildgebungsexperiment

1. Starten Sie die Tracerinfusion und die Bildgebung gleichzeitig.
2. Überprüfen Sie routinemäßig die CM-Kanüle und den PE10-Schlauch auf Anzeichen eines Lecks. Wenn ein Tracer am CM austritt, müssen die Ergebnisse dieses Experiments ausgeschlossen werden.
   HINWEIS: Wenn sich der Tracer im Kleinhirn ansammelt und nicht den glymphatischen Weg der mittleren Hirnarterien (MCA) durchläuft, ist es wahrscheinlich, dass die CM-Kanüle in das Kleinhirn injiziert wurde. Diese Daten sollten nicht aufgenommen werden.
3. Bei akuten Experimenten nehmen Sie die Maus nach Abschluss des Experiments vom Mikroskop und prüfen Sie, ob sie noch ausreichend betäubt ist. Enthaupten Sie schnell die Maus und entnehmen Sie das Hirngewebe. Tauchen Sie das Gehirn über Nacht bei 4 °C in 4 % Paraformaldehyd (PFA) ein.
   1. Bei chronischen Experimenten entfernen Sie nach Abschluss der Bildgebung die CM-Leitung aus der Kanüle, spülen Sie sie mit sterilem aCSF und verschließen Sie die CM-Kanüle wieder mit einer Hochtemperatur-Kauterspitze. Nehmen Sie die Maus vom Kopfständer und setzen Sie sie wieder in ihren Käfig ein. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis keine weitere Bildgebung erforderlich ist, und befolgen Sie dann Schritt 6.3.

Ergebnisse

Abbildung 1. Transkranielle makroskopische Bildgebung. (A) Schematische Darstellung des makroskopischen Bildgebungsaufbaus. (B) Dorsale Ansicht der Position der Kopfplatte auf dem Schädel. Sichtbar sind das ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0.25% Bupivacain HCl			University of Rochester Vivarium
100 μL Gasdichte Spritze Modell 1710 TLL, PTFE Luer Lock	Hamilton Company	81020
A-M Systems Zahnzementpulver	Fisher Scientific	NC9991371
Carprofen			University of Rochester Vivarium
Chlorhexidine	Prevantics	B10800
CMOS Kamera	Hammamatsu	ORCA Flash 4.0
Head Plate	University of Rochester	Kein Katalog #	Custom made in der Maschinenwerkstatt der University of Rochester
Hochtemperatur-Kauter	Bovie Medical Corporation	AA01
Insta-set Beschleuniger	Bob Smith Industries	BSI-151
Isofluran - Fluriso	Vet One	502017	University of Rochester Vivarium
Ketamin			Strong Memorial Hospital Apotheke
Krazy Glue	Elmer's Products, Inc	Kein Katalog #, siehe Link in den Kommentaren	https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG
Mikroporen-OP-Klebeband	Fisher Scientific	19-027-761
Paraformaldehyd	Sigma-aldrich	P6148
PE10 - Polyethylen .011" x .024" pro Fuß, 100 Fuß kontinuierlich	Braintree Scientific	PE10 100 FT
Pump 11 Elite Infusion Only Dual Spritze	Harvard Apparat	70-4501
PURALUBE VET SALBE	Dechra
Puritan PurSwab Reinigungsstäbchen mit Wattespitze	Fisher Scientific	22-029-553
Forschung Makro-Zoom-Mikroskop	Olympus	MVX10
Einfache Kopfhalterplatte (für Mäuse)	Narishige International USA Inc	MAG-1
Einwegnadeln, BD Medical	VWR	BD305106
sterile Alkoholvorbereitungspads	Fisher Scientific	22-363-750
Abstimmbare LED	PRIOR Lumen 1600-LED
Xylazin			Universität von Rochester Vivarium