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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Intravenöse Katheterisierung von Nagetieren, Virusabgabe und Glasfaserimplantation
- Bereiten Sie die Tiere auf die Operation vor.
- Betäuben Sie Ratten vollständig mit dem Anästhetikum Ihrer Wahl, basierend auf den institutionellen Richtlinien. Eine Option ist Ketaminhydrochlorid (87,5-100 mg/kg, intramuskulär [i.m.]) und Xylazinhydrochlorid (5 mg/kg, i.m.). Stellen Sie sicher, dass die Ratte vollständig betäubt ist, indem Sie überprüfen, ob kein Zehenklemmreflex vorhanden ist.
VORSICHT: Ketamin ist eine kontrollierte Substanz, die gemäß den institutionellen Richtlinien gehandhabt werden muss.
HINWEIS: In dieser Studie werden intramuskuläre Injektionen von Anästhetika verwendet, da sie eine schnellere und zuverlässigere Anästhesieeinleitung bewirken als intraperitoneale Injektionen. Überwachen Sie kontinuierlich die Atmung und Reaktionsfähigkeit der Ratte und bieten Sie während der gesamten Operation thermische Unterstützung. - Rasieren Sie einen großen Bereich des Rückens der Ratte (oberer Rücken von knapp über den Schulterblättern bis zur Mitte des Rückens) sowie den Bereich des Halses unter der rechten Vordergliedmaße und die Kopfhaut.
- Setzen Sie die Ratte in den Operationsbereich und tragen Sie puralube (künstliche Tränen) auf die Augen auf. Injizieren Sie ein Körpergewichtsvolumen von Carprofen (Analgetikum) subkutan (subkutan [s.c.]) durch die Haut des oberen Rückens, dann injizieren Sie 5 ml Laktatlösung von Ringer s.c. durch die Haut des unteren Rückens.
- Desinfizieren Sie alle Operationsstellen, indem Sie ein Stück sterile Gaze mit Betadin benetzen und mit kreisenden Bewegungen über den rasierten Operationsbereich wischen. Wiederholen Sie dann den Vorgang mit 70% Ethanol. Wiederholen Sie diesen abwechselnden Zyklus dreimal.
- Führen Sie eine intravenöse Katheterimplantation gemäß den zuvor veröffentlichten Protokollen durch.
HINWEIS: Bei dieser Operation wird kein chirurgisches Abdecktuch verwendet, um Reizungen während der Katheterimplantation zu vermeiden. Sterilisieren Sie alle Instrumente und Geräte vor dem Gebrauch. Verwenden Sie sterile Handschuhe und wechseln Sie die Handschuhe, wenn eine nicht sterile Oberfläche in Berührung kommt. - Unmittelbar nach der Katheterimplantation sichern Sie die Ratte in einem stereotaktischen Rahmen, um Adeno-assoziierte Viren (AAV) zu injizieren.
- Verabreichen Sie eine subkutane (s.c.) Injektion von 2% Lidocain (0,2-0,3 ml) auf die Kopfhaut als Lokalanästhetikum.
HINWEIS: Lokalanästhetikum wird während der intravenösen Katheterimplantation nicht verwendet, um Veränderungen des chirurgischen Ergebnisses zu vermeiden. - Verbinden Sie eine 26-Gauge-Injektionskanüle aus Edelstahl mit einer Hamilton-Spritze, die mit 1 μl konzentrierter AAV-Lösung gefüllt ist: entweder AAV5-hSyn-tdTomate oder AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
HINWEIS: oChIEF ist eine Variante des blaulichtempfindlichen Opsin-Kanalrhodopsins (ChR2), das auf einen weiten Frequenzbereich ansprechen kann und daher für die in diesem Protokoll diskutierten Experimente zur niederfrequenten Langzeitdepression (LTD) nützlich ist. aber auch für hochfrequente Langzeitpotenzierungsexperimente (LTP). Das oChIEF-Konstrukt wurde von Dr. Roger Tsien gespendet und vom Duke Viral Vector Core für die Verpackung und Reinigung verarbeitet. Zwischen dem Injektionstag und dem Tag der LTD-Induktion sind mindestens 3-4 Wochen erforderlich, um eine optimale Virusexpression im medialen Genikulatkern der Thalamus (MGN)-Axonterminalien zu ermöglichen.
VORSICHT: Im Allgemeinen wird AAV als Organismus der Biosicherheitsstufe 1 (BSL-1) mit geringem Risiko einer Selbstinfektion angesehen, es sei denn, bei seiner Herstellung wird ein Helfervirus verwendet. Ihre Verwendung erfordert die Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), und es muss jederzeit geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien verwendet werden, um unnötige Exposition zu begrenzen. - Machen Sie mit einem Skalpell einen 0,5 mm großen Schnitt von der Vorder- zur Rückseite des Schädels und entfernen Sie das darüber liegende Gewebe, um die Oberfläche des Schädels freizulegen.
- Nivellieren Sie den Kopf der Ratte in der vorderen/hinteren Achse und null stereotaktische Koordinaten zum Bregma.
- Bohren Sie drei kleine Löcher durch den Schädel mit einem Dremel-Werkzeug, das mit einem kleinen Bohrer ausgestattet ist. Verwenden Sie einen Schraubendreher, um die Schrauben aus Edelstahl (M2x4 965-A2) fest zu befestigen.
HINWEIS: Schrauben sind notwendig, um Zahnzement richtig zu binden und robuste, langlebige Kopfkappen herzustellen. Die Position der Schrauben sollte über die vorder-hintere Achse des Schädels und weg von der AAV-Injektionsstelle verteilt werden. - Bohren Sie bilaterale Löcher für die Injektion von AAV basierend auf den Koordinaten aus dem Rattenhirnatlas (Watson und Paxinos) für den medialen Teil des Nucleus geniculatus medialis (MGN); in mm von Bregma, anteroposterior (AP): -5,4; mediolateral (ML): ±3,0; dorsoventral (DV): -6,6. Senken Sie die Injektionskanülen (4 mm/min) langsam ab, bis sie im MGN positioniert sind. Injizieren Sie konzentrierte AAV-Lösung mit einer Geschwindigkeit von 0,1 μl/min.
- Lassen Sie die Injektionskanüle nach Abschluss der Infusionen 5 Minuten lang an Ort und Stelle, um eine Diffusion von der Kanüle weg zu ermöglichen, und ziehen Sie dann die Kanüle langsam aus dem Gehirn zurück.
- Fahren Sie unmittelbar nach der Virusinjektion mit der Implantation von optischen Fasern fort, die auf MGN-LA-Terminalien abzielen.
- Verwende ein Dremel-Werkzeug, um bilaterale Löcher für Glasfaserimplantate zu bohren, die auf die laterale Amygdala abzielen (in mm von Bregma, AP: -3.0; ML ±5.1).
Fassen Sie - mit einer Pinzette die Zwinge des Glasfaserimplantats und befestigen Sie sie so an den stereotaktischen Adaptern, dass sie sicher an Ort und Stelle gehalten werden.
- Senken Sie die Fasern langsam mit einer Geschwindigkeit von 2 mm/min ab, bis die Spitze der Faser im dorsalen Teil des LA sitzt (dorsoventral [DV]: -7,9 mm).
- Befestigen Sie die Aderendhülsen zuerst mit einer dünnen Schicht Loctite-Sofortkleber, gefolgt von Zahnzement, am Schädel und decken Sie die Aderendhülsen mit Aderendhülsen und Staubschutzhüllen mit einem Durchmesser von 1,25 mm ab.
HINWEIS: Die Wahl des Klebstoffs zur Befestigung der Aderendhülsen am Schädel sollte vom örtlichen oder institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -verwendung genehmigt werden. Loctite wird für diese Studie verwendet, um die Ferrulen nach Versuch und Irrtum mit mehreren Klebstoffen zuverlässig am Schädel zu befestigen; Verfügbare Alternativen können jedoch in Betracht gezogen werden.
- Nach chirurgischen Eingriffen halten sie Ratten individuell und bieten freien Zugang zu Futter und Wasser. Bieten Sie eine postoperative Versorgung in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien. Spülen Sie die Katheter täglich mit Kochsalzlösung, die Gentamicin (5 mg/ml) und Heparin (30 USP/ml) enthält, um die Durchgängigkeit aufrechtzuerhalten. Mindestens 5 Tage nach der Operation und 24 Stunden vor Beginn der Verhaltensexperimente beschränkt das Futter die Ratten auf ~90% ihres Freifütterungsgewichts.
2. Selbstverabreichung von Kokain bei Nagetieren und Extinktion des instrumentellen Hebels
HINWEIS: Alle Verhaltensverfahren werden in standardmäßigen operanten Konditionierungskammern durchgeführt, die mit zwei einziehbaren Hebeln an einer Wand, einem Stimuluslicht über jedem Hebel, einem Tongenerator, einem Hauslicht und einer Infusionspumpe ausgestattet sind.
- Unterziehen Sie Ratten täglichen 1-stündigen Selbstverabreichungstrainingssitzungen mit Kokain (2 mg/ml) unter einem Verstärkungsplan mit festem Verhältnis 1 (FR1).
- Setzen Sie die Ratten jeden Tag in eine operante Kammer und lassen Sie die Ratten den Hebel drücken. Ein Druck auf den dafür vorgesehenen "aktiven Hebel" (ausbalanciert zwischen linkem und rechtem Hebel) führt zu einer Kokaininfusion (1,0 mg/kg/Infusion) und einer 10-s-Präsentation eines zusammengesetzten Licht- und Tonhinweises. Ein Druck auf den dafür vorgesehenen "inaktiven Hebel" hat keine programmierten Auswirkungen.
- Setzen Sie die Selbstverabreichungsversuche mindestens 10 Tage lang fort und bis die Ratten an 3 aufeinanderfolgenden Tagen mindestens 8 Infusionen/Tag erhalten haben. Das Nichterreichen der Akquisitionskriterien bis zum 20. Tag führt zum Ausschluss aus der Studie.
- Nachdem die Akquisitionskriterien erfolgreich erfüllt wurden, unterziehen Sie die Ratten 1-stündigen instrumentellen Extinktionssitzungen für 6-10 d.
- Platzieren Sie die Ratten in operanten Kammern und lassen Sie die Ratten frei hebeln. Reaktionen sowohl auf den aktiven als auch auf den inaktiven Hebel haben jedoch keine programmierten Konsequenzen.
- Lassen Sie Ratten die instrumentelle Extinktion täglich fortsetzen, bis durchschnittlich < 25 Hebeldrücke an zwei aufeinanderfolgenden Tagen auftreten.
3. In vivo Optogenetische Induktion von LTD
HINWEIS: Optogenetische Inhibitionsexperimente finden 24 Stunden nach dem letzten Tag der instrumentellen Extinktion statt.
- Verbinden Sie Patchkabel mit einer blauen 473-nm-Laserdiode über ein Drehgelenk, das über einem sauberen, standardmäßigen Nagetiergehäusekäfig hängt, wobei die Abdeckung entfernt ist. Dieser Aufbau ermöglicht es den Nagetieren, sich während der optogenetischen Stimulation frei im Käfig zu bewegen.
- Schalten Sie die Laserdiode gemäß der Bedienungsanleitung ein und schließen Sie sie an einen Impulsgenerator an. Passen Sie die Einstellungen so an, dass die Ratte beim Einschalten 900 Lichtimpulse von 2 ms bei 1 Hz empfängt.
ACHTUNG: Während des Betriebs des Lasers muss jederzeit ein geeigneter Augenschutz verwendet werden. - Messen Sie die Lichtintensität durch das Patchkabel mit einem Lichtsensor. Stellen Sie die Intensität des Lasers so ein, dass die Lichtabgabe über das Patchkabel ~5-7 mW beträgt.
- Setzen Sie Ratten in einen sauberen Käfig. Entfernen Sie die Staubschutzhüllen und Aderendhülsen, wodurch die Aderendhülsen freigelegt werden. Verbinden Sie Patchkabel beidseitig mit den Glasfaserimplantaten. Lassen Sie die Ratten die Umgebung 3 Minuten lang erkunden, bevor Sie die LTD einleiten.
- Schalten Sie den Impulsgenerator ein, um die optogenetische Stimulation einzuleiten.
HINWEIS: Obwohl unwahrscheinlich, wird das Experiment sofort beendet, wenn bei Ratten Nebenwirkungen auf die Stimulation auftreten, und die Ratten werden gemäß den institutionellen Richtlinien ordnungsgemäß eingeschläfert. - Halten Sie die Ratten nach der LTD-Induktion 3 Minuten lang im Käfig und setzen Sie sie dann wieder in ihre Heimkäfige.
- Für Kontrollexperimente ist das gleiche Stimulationsverfahren an Ratten anzuwenden, die das AAV5-tdTomato-Kontrollvirus exprimieren. Für Scheinexperimente schließen Sie ein Patchkabel an die optische Faser von Ratten an, die das AAV5-oChIEF-Virus exprimieren, aber während einer 15-minütigen Sitzung wird keine Stimulation abgegeben.
4. Testen Sie die Wirkung optogenetischer Stimulation auf die durch Reize induzierte Kokainsuche
- 24 Stunden nach der optogenetischen In-vivo-Stimulation setzen Sie Ratten wieder in operante Konditionierungskammern. Ratten werden einer 1-stündigen Standard-Cue-induzierten Wiedereinsetzungssitzung unterzogen, um das Verhalten bei der Kokainsuche zu beurteilen.
HINWEIS: Während der Cue-induzierten Wiedereinsetzung führt eine Reaktion auf den aktiven Hebel zu einer 10-sekündigen Präsentation des Kokain-assoziierten Stimulus, aber zu keinen Kokaininfusionen. - Führen Sie mindestens 1 Woche nach dem ersten Test einen zweiten Wiedereinsetzungstest durch, um festzustellen, ob die Induktion der optogenetischen LTD zu einer langfristigen Unterdrückung der Kokainsuche führt