Tiefengewebsbildgebung eines Zebrafischgehirns mit einem Drei-Photonen-Fluoreszenzmikroskop

Zusammenfassung

Quelle: Hontani, Y., et al. Drei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie im Tiefengewebe in intakten Gehirnen von Mäusen und Zebrafischen. J. Vis. Exp. (2022)

Dieses Video zeigt den Aufbau und die Durchführung der Drei-Photonen-Bildgebung in einem anästhesierten Zebrafischgehirn. Das Protokoll ermöglicht die Visualisierung von fluoreszenzmarkierten Neuronen in der Tiefengewebe und enthüllt so die neuronale Aktivität und Struktur in Echtzeit für neurowissenschaftliche Forschungsanwendungen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Intravitale Bildgebung im Zebrafischgehirn
   HINWEIS: Um das Fischgehirn unter der Objektivlinse richtig zu lokalisieren, wird eine CCD-Kamera (Secondary Charge-Coupled Device) auf dem gleichen Weg wie das Anregungslicht für die Weitfeldbildgebung verwendet.
   
   1. Richten Sie das Mikroskop ein und kalibrieren Sie die Leistung.
   2. Platzieren Sie ein Objektiv mit geringer Vergrößerung (in der Regel 4x) auf dem Mikroskop.
   3. Legen Sie die Petrischale mit dem Fisch und den Röhrchen unter das Mikroskop.
   4. Verwenden Sie eine Leuchtdiode (LED)-Lichtquelle, um die Petrischale zu beleuchten.
   5. Öffnen Sie den Kameramodus der Bilderfassungssoftware (Abbildung 1).
   6. Klicken Sie auf Live.
   7. Wählen Sie Kanal A auf der rechten Seite des Bildschirms.
   8. Passen Sie die Histogrammeinstellungen an, um das Bild deutlich zu sehen.
      HINWEIS: Diese müssen bei Bedarf aktualisiert werden.
   9. Legen Sie die Motoreinstellung an der Motorsteuerung auf Base fest.
   10. Senken Sie das Objektiv ab, bis der Fisch sichtbar ist.
       HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Objektivlinse keinen physischen Kontakt mit dem Kopf hat.
   11. Platzieren Sie die Mitte des Fischkopfes in der Mitte des Sichtfelds.
   12. Bewegen Sie das Ziel nach oben und weg vom Fischkopf.
   13. Ersetzen Sie die Objektivlinse mit geringer Vergrößerung durch die Objektivlinse mit hoher numerischer Apertur (NA) für 3PM (Drei-Photonen-Mikroskopie).
       HINWEIS: Die Linse mit niedriger Vergrößerung und die Objektivlinse mit hoher NA müssen nicht parfokal sein, sondern müssen nahe genug sein, um sicherzustellen, dass sich der Fisch im Sichtfeld der Objektivlinse mit hoher NA befindet.
   14. Senken Sie die Objektivlinse langsam ab und stellen Sie sicher, dass das Objektiv keinen physischen Kontakt mit dem Kopf hat. Beenden Sie in der CCD-Kamerasoftware die Bewegung des Objektivs, wenn die Oberseite des Kopfes sichtbar ist. Stellen Sie die z-Position auf 0 μm ein.
       HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen unter der Objektivlinse befinden, wenn Sie ein Wasserimmersionsobjektiv verwenden.
   15. Schalten Sie die LED-Lichtquelle aus und schließen Sie den dunklen Vorhang um das System.
   16. Stellen Sie die Bilderfassungssoftware auf den Multiphotonen-GG-Modus für 3P-Bildgebung ein und stellen Sie die Leistung unter der Objektivlinse auf weniger als 1 mW (mit ~1 MHz Impulswiederholrate) ein.
   17. Ändern Sie die Motoreinstellungstaste auf der Motorsteuerung von Base auf Objective.
   18. Schalten Sie das Licht im Raum aus.
   19. Schalten Sie die Photomultiplier-Röhren (PMTs) ein und öffnen Sie den Shutter der 3PM-Anregungsquelle. Stellen Sie sicher, dass aufgrund der Autofluoreszenz im Fluoreszenzsignalkanal und aufgrund des THG-Effekts des Knochens im Signalkanal der dritten harmonischen Generation (THG) ein Umriss des Knochens erscheint (Abbildung 1C).
   20. Führen Sie Bildgebung in unterschiedlichen Tiefen durch, indem Sie die Leistungsstufen erhöhen, wenn Sie tiefer fotografieren.

Ergebnisse

Abbildung 1: Repräsentative Screenshots für die intravitale Bildgebung bei Fischen (Protokollabschnitt 1).) Ansicht des Kameramodus der Bilderfassungssoftware mit 4-fach-Objektiv. Die wichtigsten Funktionen der Software sind...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
5% Povidon-iod	Amazon	NDC 67818-155-32	Akzeptische Reinigung von chirurgischen Bereichen
70% Ethanol	Thermo Fisher Scientific	CAS 64-17-5	Akzeptische Reinigung von chirurgischen Bereichen
Agarose	Sigma	A4718-256	Vorbereitung der Zebrafischkammer
Bergamo II	Thorlabs		Multiphoton Imaging Mikroskop
Bupivacaine	Cornell Veterinary Care
GaAsP Amplified PMT	Thorlabs	PMT2100	PMT Detektor
Heizung (800 W)	Finnex		Aquarium Heizung für Zebrafischwasser)
Kimwipes	Kimtech		Laborgewebe zur Vorbereitung von Zebrafischen
Nanofil-Spritze (10 Mikrometer) mit 36-G-Nadel	WPI	NANOFIL + NF36BV	Spritze und Nadel zur Injektion von Pancuroniumbromid
Peristaltische Pumpe	Elemental Science	ESI MP2	Wasserpumpe für die Einrichtung von Zebrafischen
Polyethylenschlauch (Innendurchmesser 0,58 mm, Außendurchmesser 0,965 mm.)	Elemental Science	MP2-Pumpenschlauch	Schlauch, der in das Maul des Zebrafisches geht
SR400	Stanford Research Systems	SR400	Photonenzähler
Standard Photodiode Leistungssensor	Thorlabs	S122C	Leistungsdetektor
Dünnstreifen-Boxwachs	Corning Rubber Co., Inc.		Halten des Schlauchs in der Zebrafischkammer
ThorImage	Thorlabs		Bildaufnahmesoftware
Tricain (Ethyl-m-Aminobenzoat, Methansulfonat, Salz)	MP	103106	Anästhesie und Euthanasie von Zebrafischen
Tygon-Schlauch (ID 1/16 Zoll, Außendurchmesser 1/8 Zoll)	Tygon		Schlauch für den Wasserfluss für die Zubereitung von Zebrafischen
VaporGuard	VetEquip	931401	Zum Recycling von Isofluran
Vetbond Gewebekleber	3M	1469SB	Zum Verkleben des Glasfensters auf dem Mäuseschädel und zum Verkleben des Laborgewebes bei der Vorbereitung der Fische.
XLPLN25XWMP2	Olympus		Multiphotonen-Anregungsobjektiv