Bildgebung der Migration von Tumorzellen im Glioblastomgewebe mittels konfokaler Zeitraffer-Scanning-Mikroskopie

Zusammenfassung

Quelle: Parker, J. J., et al. Ein organotypisches Schnittkulturmodell des humanen Glioblastoms zur Untersuchung der Migration von Tumorzellen und der patientenspezifischen Wirkungen von antiinvasiven Medikamenten. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video zeigt die Bildgebung von Glioblastom-Gewebeschnitten, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimieren, mittels konfokaler Mikroskopie. Hochauflösende Bilder werden in gleichbleibenden Abständen aufgenommen, um die Bewegung und Richtung der Tumorzellen zu verfolgen.

Protokoll

Alle Verfahren zur Probenentnahme wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

1. Markierung von Tumorzellen über grün fluoreszierendes Protein, das Retroviren exprimiert

HINWEIS: Die Zeitraffermikroskopie zur Analyse der Tumorzellmigration erfordert eine stabile, langfristige Fluoreszenzmarkierung von Zellen innerhalb der Schnittkultur. Die Verwendung von Retroviren wird empfohlen, da sie selektiv sich teilende Zellen infizieren und dadurch die Fluoreszenzmarkierung innerhalb der Tumorzellpopulation im Gegensatz zu Mikroglia oder anderen Zelltypen, die in der Scheibe vorhanden sind, anreichern. Die Standardisierung der Infektion deutet darauf hin, dass ein viraler Titer von 10⁴ KBEs/μl zu einer ausreichenden grün fluoreszierenden Proteinexpression für die Verfolgung und Analyse der Zellmigration führt. Ein erhöhter Virustiter, die Verwendung von nicht-selektiven Viren (d. h. Adenovirus, Lentivirus) oder andere Mittel zur Markierung aller Zellen können die Identifizierung klarer Zellgrenzen während der Migration ausschließen, was die Analyse erschwert. Der Einsatz alternativer Fluoreszenzmarker kann je nach Bedarf genutzt und optimiert werden.

1. Beziehen Sie Retroviren für die Infektion von Tumorschnitten entweder über Standardprotokolle5,14 oder aus einer kommerziell erhältlichen Quelle. Der Virusüberstand wird durch Zugabe des entsprechenden Volumens in ein nicht supplementiertes neuronales Medium verdünnt, um einen Virustiter von 10⁴ KBE (koloniebildende Einheiten) /μl zu erreichen.
2. Zwischen 7 und 10 Tagen Kultur infizieren die interessierenden Tumorschnittkulturen mit 5 - 10 μl Virus (10⁴ KBE/μl). Legen Sie das Virus vorsichtig tropfenweise auf die Oberfläche jeder Gewebescheibe. Verringern Sie das hinzugefügte Überstandsvolumen, wenn die Scheibe auf der Oberfläche des Einsatzes schwimmt. Bringen Sie Platten mit Schnittkulturen in einen Inkubator zurück.
3. Beurteilen Sie die Schnitte für markierte Tumorzellen ab 24 Stunden nach der Virusinfektion. Diese Zeitverzögerung variiert je nach viralem Einbau und Fluoreszenz-Genexpressionskinetik. Für die hier verwendeten viralen Konstrukte waren 72 h erforderlich, um ein robustes Fluoreszenzsignal mit einem Standard-Epifluoreszenzmikroskop zu beobachten.
   HINWEIS: In seltenen Fällen weisen Schnitte eine überwiegend periphere Verteilung von viral markierten Zellen auf, was die konfokale Bildgebung erschweren kann. Um diese Komplikation zu vermeiden, versuchen Sie, die Schichtdicke und die Dickenvariation über die Scheibe hinweg zu reduzieren. Wenn die Scheibenkultur eine dickere Region in der Nähe des Zentrums aufweist, kann dies eine ausreichende Nährstoffpenetration verhindern und somit die Population der sich aktiv teilenden Tumorzellen einschränken. Ein qualitativer Assay zum Screening auf diese Komplikation ist die Zugabe eines Tetrazoliumfarbstoffreagenzes (d. h. MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid)) zu dem Scheibenkulturmedium. Bereiche der Schnitte, die sich nach der Zugabe des Reagenzes nicht blau verfärben, weisen auf einen Mangel an Stoffwechselaktivität und eine beeinträchtigte Gesundheit der Scheibe hin.

2. Konfokale Einzelphotonen-Laser-Scanning-Bildgebung der Tumorzellmigration im Zeitraffer

HINWEIS: Nach erfolgreicher Transduktion und Bestätigung des Zustands der Kultur können die Zellen unter Kontrollbedingungen abgebildet werden, gefolgt von einer gleichen Bildgebungsphase unter Behandlungsbedingungen. Mit diesem Protokoll wurden die Zellen erfolgreich abgebildet und unter jeder Bedingung 12 Stunden lang verfolgt. Aber auch kürzere oder längere Zeiträume der Bildgebung und Umweltmanipulation können informativ sein.

1. Laden des Mikroskops
   1. Legen Sie vor der Bildgebung 1 ml frisches Scheibenmedium in eine Glasbodenschale.
   2. Lassen Sie das Medium in der Glasbodenschale 15 Minuten lang in einem Inkubator äquilibrieren
      HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können lösliche Markierungsmittel, wie z. B. fluoreszierend konjugierte Lektine (d. h. Isolectin IB4 für die Mikroglia-Markierung) oder ligandenkonjugierte Quantenpunkte, zu den Scheibenkulturmedien hinzugefügt werden, um zelluläre Subpopulationen während der Bildgebung zu identifizieren.
   3. Übertragen Sie den zu bebildernden Einsatz mit einer sterilen Pinzette in einer Laminar-Flow-Haube in eine Glasbodenschale. Transportieren Sie die Schüssel zum Mikroskoptisch.
   4. Bewahren Sie die Schnittkulturen bei 37 °C und 5 % CO₂ -Atmosphäre in einem versiegelten Mikroskop-Inkubator auf. Verwenden Sie eine sterile H₂O-Befeuchtung der Inkubationskammer, falls verfügbar, um eine übermäßige Verdunstung des Mediums zu verhindern (besonders wichtig bei längeren bildgebenden Experimenten).
   5. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop mit großem Arbeitsabstand, 10-fachem Luftobjektiv und Laseranregung für Einzelphotonen und/oder Multiphotonen. Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass die Objektivlinse des Mikroskops einen ausreichenden Arbeitsabstand bietet. Aufgrund der zusätzlichen Höhe des Inkubators auf der Bühne, der Glasbodenschale und des Gewebekultureinsatzes sind Objektive mit großem Arbeitsabstand von entscheidender Bedeutung.
   6. Befestigen Sie die Glasbodenplatte, entfernen Sie die Petrischalenabdeckung aus Kunststoff und decken Sie sie mit einer gasdurchlässigen Membran ab.
2. Image Acquisition
   Verwenden
   1. Sie das Mikroskop, um die Scheibe visuell zu inspizieren, und lokalisieren Sie ein geeignetes Feld mit ausreichender Dichte an fluoreszenzmarkierten Tumorzellen zwischen dem Schnittrand und der Mitte. Vermeiden Sie Bildgebungsfelder am Rand der Schnitte, da die Anfälligkeit für Gewebeverschiebungen während der Bildgebung erhöht ist. Gewebescheibenharfen können eingesetzt werden, um diese Verschiebung zu begrenzen.
   2. Verwenden Sie eine Bildgebungssoftware im mehrdimensionalen Analysemodus, um die erste (untere) und letzte (oben) Z-Stapel-Begrenzung so festzulegen, dass alle abzubildenden Positionen ein sichtbares fluoreszierendes zelluläres Signal enthalten. Die Bildgebung durch 150 - 200 μm der Scheibe mit einem konstanten Z-Schritt von 10 μm bot eine ausreichende Auflösung für die Verfolgung von Zellpfaden (dies kann an individuelle Bildgebungsanforderungen angepasst werden).
   3. Wenn das Mikroskop über einen motorisierten Tisch verfügt, stellen Sie sicher, dass für jede Z-Stapel-Aufnahme ausreichend Zeit eingeplant ist. Stellen Sie das Zeitintervall zwischen den Aufnahmen auf die Scanzeit pro Position x Anzahl der abzubildenden Positionen (d. h. abgebildete Tumorregionen) ein.
      HINWEIS: Für die gleichzeitige Anregung der grünen und roten Fluorophore verwenden Sie ein Dual-Line-Laser-Line-Scanning-Programm mit gleichzeitiger Anregung von 488 nm und 633 nm. Die Wellenlänge der gewählten Laseranregung variiert je nach den einzelnen exprimierten fluoreszierenden Proteinen.
   4. Behalten Sie eine gleichmäßige Laserleistung und konfokale Lochblendeneinstellungen zwischen den abgebildeten Tumorregionen bei. Verwenden Sie die niedrigste Laserleistungseinstellung, die erforderlich ist, um die Tumorzellkörper und -prozesse klar abzugrenzen und so die Phototoxizität zu begrenzen. Spezifische Bildgebungsparametereinheiten (d. h. Leistungs- und konfokale Lochblendeneinstellungen) variieren je nach den Spezifikationen des Mikroskops und der Laserquelle.
   5. Kompensieren Sie eine mögliche Verdunstung des Mediums, indem Sie 2 - 3 "Puffer"-Z-Stapel-Schritte in den Fokusebenen hinzufügen, die zum Objektiv vordringen. Dadurch wird effektiv verhindert, dass das Gewebe den Bereich der Z-Stapel-Aufnahmen in der vertikalen Ebene verlässt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM High Glucose	Invitrogen (Gibco)	11960-044
Neurobasal-A Medium, minus Phenolrot	Invitrogen (Gibco)	12349-015
B-27 Supplement (50X), serumfreies	Invitrogen (Gibco)	17504-044
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Invitrogen (Gibco)	15140-122
GlutaMAX Supplement	Invitrogen (Gibco)	35050-061
L-Glutamin (200 mM)	Invitrogen (Gibco)	25030-081
HEPES (1 m)	Invitrogen (Gibco)	15630-080
Nystatin Suspension	Sigma-Aldrich	N1638-20ML	10.000 Einheiten/ml in DPBS, aseptisch verarbeitet, BioReagenz, geeignet für Zellkulturen
UltraPure Low Melting Point	Agarose Invitrogen (Gibco)	16520-050	Schmilzt bei 65,5 °C, bleibt bei 37 °C flüssig und härtet schnell unter 25 °C aus.
Isolectin GS-IB4 aus Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Konjugat	Thermo Fisher (Molekulare Sonden)	I32450	Wird in Medien zur Markierung von Mikroglia/Makrophagen
verwendet pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vektor	Clonetech	632520
Retro-X Concentrator	Clonetech	31455	Bindungsharz für die Nicht-Ultrazentrifugationskonzentration von Virusüberständen
pVSG-G Vektor	Clonetech	631530	Teil des Retro-X Universal Retroviral Expression Systems
GP2-293 Virale Verpackungszellen	Clonetech	631530	Teil des Retro-X Universal Retroviral Expression System
Cyanoacrylate Glue (Super Glue)	Sigma-Aldrich	Z105899	Mittelviskose
Peel-A-Way Einbettungsform (quadratisch - S22)	Polysciences, Inc.	18646A-1	Formen zum Einbetten von Tumorproben
Mikrospatel aus Edelstahl	Fisher Scientific	S50823	Biegeinstrument um 45 Grad am Hals der Löffelklinge
Gebogene Fisherbrand Präparierzange mit feiner Spitze	Fisher Scientific	08-875
Einschneidige Rasierklinge (amerikanische Rasierapparate)	Fisher Scientific	17-989-001	Die Klingenschneide ist 0,009" dick. Die gewellte Abdeckung mit stumpfer Kante wird vor dem Laden auf Vibratome entfernt.
Leica VT1000 S Vibratom	Leica Biosystems	VT1000 S
Hydrophiler PTFE-Zellkultureinsatz	EMD Millipore	PICM0RG50	30 mm, hydrophiles PTFE, 0,4 μm Porengröße
35 mm Glasbodenschalen	MatTek	P35G-1,5-20-C Hülse	20 mm Glasdurchmesser. Deckglas Dicke 1,5
LSM 510 Konfokales Mikroskop	Zeiss	LSM 510	10x Air Objektiv (c-Apochromat NA 0,45)
PECON Stagetop Inkubator	PeCON Deutschland	(eingestellt)	Der Inkubator PM 2000 RBT ist ein vergleichbares Produkt, das für den Einsatz mit Zeiss Mikroskopen entwickelt wurde.