Spontane Kalzium-Bildgebung für kompartimentspezifische Dynamik in Astrozyten

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Quelle: Bannai, H., et. al., Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators. J. Vis. (2019)

Das Video demonstriert die Fluoreszenzbildgebung zur Beobachtung der kompartimentspezifischen spontanen Kalziumdynamik in Astrozyten durch sequentielle Überwachung von Kalzium-sensitiven Proteinen, die auf der Plasmamembran und dem endoplasmatischen Retikulum lokalisiert sind.

Protokoll

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1. Ca²⁺ Bildgebung

Aufzeichnung spontaner Aktivitäten von Astrozyten, die Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f/
/>HINWEIS: Ohne bildaufteilende Optik können die Ca²⁺-Signale an der Plasmamembran und um das endoplasmatische Retikulum (ER) in derselben Zelle überwacht werden. Hier wird die sequentielle Aufzeichnung von Lck-RCaMP2 (Plasma membrane-targeted genetisch kodierter Ca²⁺ Indikator) und OER-GCaMP6f (Outer endoplasmic reticulum membrane-targeted genetisch kodierter Ca²⁺ Indikator) in denselben Astrozyten beschrieben. Ein Öl-Immersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur größer als 1,3 wird für spontane Ca2⁺-Aktivität dringend empfohlen.
Schalten Sie das Mikroskop, die Kamera, die Lichtquelle und die Mikroskop-Heizkammer mindestens 30 Minuten lang ein, bevor Sie aufnehmen.
Montieren Sie das Deckglas mit den mit Lck-RCaMP2 und OER-GCaMP6f transfizierten Zellen in die Aufnahmekammer und fügen Sie 400 μl des Bildgebungsmediums hinzu. Setze einen Deckel auf die Kammer.
Wählen Sie das Filterset für GCaMP6f und die Lichtquelle (blaues Anregungslicht, z.B. 470 – 490 nm; siehe Materialtabelle). Lokalisieren Sie die Astrozyten, die OER-GCaMP6f exprimieren.
Wählen Sie ein Filterset und die Lichtquelle für RCaMP2 (grünes Anregungslicht, z.B. 510–560 nm; siehe Materialtabelle) und bestätigen Sie, ob Lck-RCaMP2 in denselben Astrozyten exprimiert wird. Vermeiden Sie eine lange Exposition gegenüber der Lichtquelle, um Photobleaching zu vermeiden.
Nehmen Sie Zeitrafferbilder von Lck-RCaMP2 bei 2 Hz für 2 Minuten auf. Speichern Sie die Bilddaten auf der Festplatte.
Ändern Sie den Filtersatz auf den für GCaMP6f. Nehmen Sie Zeitrafferbilder von OER-GCaMP6f im gleichen Sichtfeld bei 2 Hz für 2 Minuten auf. Speichern Sie die Daten auf der Festplatte.
Analysieren Sie die Daten mit der Bildanalysesoftware.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
kreisförmige Deckgläser mit einem Durchmesser von 18 mm	Karl Hecht "Assistent"	#41001118	Dicke 1, kreisförmige Deckgläser mit einem Durchmesser von 18 mm; alternative Deckgläser können verwendet werden.
Kamera zur mikroskopischen Bildaufnahme			Folgende Kameras standen zum Einsatz zur Verfügung: gekühlte CCD-Kamera (z.B. Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD-Kamera (z.B. Hamamatsu Photonics, ImagEM; Andor, iXon) oder CMOS-Kamera (z. B. Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)
Bildanalysesoftware			wie Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH) und TI Workbench14 (kundenspezifisch)
Bildgebungsmedium und Puffer			Verwenden Sie das optimale Medium oder den optimalen Puffer für das Experiment. Bei der Verwendung von Medium ist ein Medium ohne Phenolrot wünschenswert, um die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren. Fügen Sie 20 mM HEPES hinzu, um den pH-Wert außerhalb des Kohlendioxid-Inkubators aufrechtzuerhalten.
Inverses Fluoreszenzmikroskop			wie z.B. IX73 (Olympus) oder Eclipse TI (Nikon Instech)
Mikroskop-Filterset für GCaMP6f-Bildgebung			Geeigneter Filter für GFP (Anregung, 480 ± 10 nm; Emission, 530 ± 20 nm)
Mikroskop-Filterset für RCaMP2-Bildgebung			Geeigneter Filter für RFP (Anregung, 535 ± 50 nm; Emission, 590 nm Langpass)
Mikroskop-Heizsystem			Ein Heizsystem, um die Zellen während der Bildgebung auf 37 °C zu halten. Um Drift durch Wärmeausdehnung zu vermeiden, werden Heizsysteme empfohlen, die das gesamte Mikroskop selbst abdecken (z. B. Tokai Hit, Thermobox).
Mikroskop-Lichtquelle zur Anregung			Quecksilberlampe (100 W), Xenonlampe (75 W), Leuchtdiode (LED) Beleuchtungssystem (z. B. CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wellenlängen-LED-Quelle; Lumencor, SPECTRA X Light Engine). Im Falle von Quecksilberklumpen und Xenonlampen verwenden Sie einen ND-Filter, um die Anregungsintensität zu reduzieren.
Das			Plan-Apochromat-Ölimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von mehr als 1,3 wird für die Aufzeichnung der spontanen Ca²⁺-Aktivität in Neuronen und Astrozyten dringend empfohlen.
Aufnahmekammer	Elveflow	Ludin-Kammer	Diese Aufnahmekammer ist für runde Deckgläser mit einem Durchmesser von 18 mm.
Stereomikroskop			Wird verwendet, um Hippocampi zu sezieren. Olympus SZ60 oder gleichwertige Stereomikroskope sind erhältlich.

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