Akute und chronische taktile Sensorische Testung nach Verletzungen des Rückenmarks bei der Ratte

Zusammenfassung

Wir beschreiben zwei taktilen sensorischen Prüfmethoden für akute oder chronische Perioden von Rückenmarksverletzungen bei Ratten. Diese validierten Verfahren kann erkennen, die Entwicklung und Wartung von Allodynie-ähnliche Empfindungen.

Zusammenfassung

Rückenmarksverletzung (SCI) beeinträchtigt sensorischen Systemen verursachen Allodynie ^1-8. Um zellulären und molekularen Ursachen der Allodynie, sensible und sensorische Prüfung gültig in Ratten-SCI Modelle zu identifizieren benötigt wird. Doch bis vor kurzem hatte kein einziges Prüfansatz SCI validiert, so dass standardisierte Methoden nicht über Labors umgesetzt. Darüber hinaus könnte Verfügung Prüfverfahren nicht akut implementiert werden, oder wenn schwere motorischen existiert, zu verhindern Studien zur Entwicklung von SCI-Allodynie ^3. Hier präsentieren wir zwei validierte sensorische Prüfverfahren mit Hilfe von-Frey-Haar (VFH) Monofile, die Veränderungen in der taktilen sensorischen Schwellen nach einer Rückenmarksverletzung ^4-5 quantifizieren. Ein Test ist das gut etablierte Up-Down-Test die hohe Sensitivität und Spezifität in verschiedenen Schweregraden SCI bei der Prüfung chronisch ⁵ demonstriert. Der andere Test ist ein neu entwickelter Test, der dorsalen VFH akut nach einer Rückenmarksverletzung kann angewendet werden, wenn einllodynia entwickelt, vor dem Motor Recovery ^5.4. Jeder VFH Monofilament gilt eine kalibrierte Kraft, wenn die Haut der Hinterpfote, bis er beugt sich gerührt. In der Auf-Ab-Methode werden abwechselnd VFHs höherer oder niedrigerer Kräfte auf die plantare Dermatom L5 verwendet werden, um flexor Rücknahmeschwellen abzugrenzen. Sukzessiv höhere Kräfte aufgebracht, bis Austritt erfolgt dann geringere Kraft VFHs sind bis zum Rücktritt nicht mehr verwendet. Die taktile Schwelle spiegelt die Kraft, die zum Rückzug in 50% der Reize zu entlocken. Für den neuen Test wird jedes VFH zum dorsalen L5 Dermatom der Pfote angelegt, während die Ratte vom Prüfer unterstützt wird. Die VFH Stimulation erfolgt in aufsteigender Reihenfolge der Kraft, bis mindestens 2 von 3 Anwendungen an einem gegebenen Kraft erzeugt Zurückziehen der Pfote. Taktile sensorische Reizschwelle ist die niedrigste Kraft zum Rücktritt 66% der Zeit zu entlocken. Akklimatisierung, Prüf-und Scoring-Verfahren werden beschrieben. Aberrant Studien, die eine typische und Retest-Studien erfordern definiert sind. Tierische Verwendung wwie von der Ohio State University Animal Care und Use Committee gebilligt.

Protokoll

1. Up / Down Plantar Von-Frey-Testing

Der Zweck des Tests ist es, taktile Empfindlichkeit gemessen, wie viel Kraft benötigt wird, um Pfote Rücktritt vom Reiz entlocken zu bestimmen. Im Handel erhältliche Von-Frey-Haar kalibriert Monofilamente zwischen den Bereichen von 4,56 und 6,10 verwendet werden, um die Pfote zu stimulieren. Andere sensorischen Input wie Visualisierung des Reizes oder Propriozeption kann verwirren taktile Schwelle Maßnahmen so Antworten auf visuelle oder propriozeptive Input basiert ungültig sind. Um die Visualisierung des Monofilaments Berühren der Haut zu verhindern, testen wir nur während der Ratte Müsli zu essen. Diese kognitive Distraktor, auch sichergestellt, dass alle Ratten in ähnlicher Ausgangswert von Komfort getestet. Um Reaktionen aufgrund propriozeptiven anstatt taktile Eingabe zu vermeiden, haben wir nicht zählen Studien, in denen das Monofilament hebt oder bewegt die Pfote.

A. Akklimatisierung VERFAHREN FÜR DIE UP-DOWN-ANSATZ

1. Präsente Frucht cereal im Käfig Ratten und so erkennen, suchen das Essen Belohnung. Ratten brauchen nicht zu essen an jedem beliebigen Punkt in der Gentling oder Prüfvorgang nicht entzogen werden.
2. Ratten sind bereit, auf die Testumgebung und Verfahren akklimatisiert werden, wenn sie Früchte Müsli im Käfig essen. Akklimatisierung erfolgt über mindestens 4 Sitzungen von jeweils 10 Minuten, aber mehr notwendig sein kann. Zehn-Minuten-Sitzungen verwendet werden, so dass die Ratten nicht überdrüssig werden vor dem Ende der Sitzung.
3. Legen Sie die Ratte in der Testkammer mit drei Stück Obst Getreide. Zusätzliche Frucht Getreide 01.59 zu einem Zeitpunkt, als sie gegessen werden. Auf der dritten Sitzung, während die Ratte essen, produzieren Handbewegungen unter dem Draht Boden, so dass die Ratten gewöhnt sich an Bewegung unter seiner Pfote. Auf der vierten Sitzung, gelten die 5,18 Monofilament zur Fußsohle der Pfote etwa einmal pro Minute für insgesamt zehn Vorträge. Eine Ratte sollte nicht naiv zu dieser Sub Schwelle Reiz zu reagieren.
4. Hochy die Stücke von Getreide verbraucht, die Häufigkeit der Wasserlassen und Stuhlgang, Einfrieren, und Körperpflegeprodukten für Verhaltensweisen. Freezing Verhalten tritt in zweierlei Hinsicht: a) die Ratte hockte tief am Boden meist in der Nähe der Rückwand oder abgewandten dem Prüfer und bewegungslos bleibt, b) der Ratte wird über in der Mitte des Käfigs kauerte und in der Regel Chatter seine Zähne . Einfrieren Verhalten kann für längere Zeit andauern.
5. Ein gentled Ratte, die zum Testen bereit ist, wird fast ständig essen für 10 Minuten. Es wird leicht in den Käfig und sucht Obst Getreide sehr schnell nach dem Verzehr des letzten. Wichtig ist, dass die Ratte nicht aufhören zu essen oder durch Handbewegungen unter dem Draht Boden oder Monofilament Anwendung auf die Pfote ablenken lassen.

B. Prüfung VERFAHREN FÜR DIE UP-DOWN-ANSATZ

1. Ratten produzieren Not Lautäußerungen, die über unsere menschlichen auditiven Bereich sind. Ratten warten darauf, getestet werden sollte in einem separaten Raum aufbewahrt werden, damit sie nicht hören können, diese VOCplausibel zu.
2. Ratten mit Rückenmarksverletzungen, die angemessen sind für die Auf-Ab-von-Frey-Haar-Tests muss Belastung mit den Gliedmaßen zu demonstrieren. Gliedmaßen, die nicht in der Lage, um die Ratte zu unterstützen sind nicht zuverlässig getestet werden, da die Anwendung von Monofilamenten bewegt die Pfote vor den Haaren beugt.
3. Legen Sie eine Ratte in der Testkammer mit 2 oder 3 Stück Obst Getreide. Die Ratten müssen in jedem VFH Anwendung zu essen.
4. Wirf einen Würfel zu bestimmen, welche HL zu dem Testen beginnen zuerst. Auch Zahlen stehen für die rechte Pfote und ungerade Zahlen stehen für die linke.
5. Beginnen Sie mit der Test-Session mit dem 5,18 Monofil. Wegziehreaktionen kann 4,56 bis 6,10 in normalen und SCI-Ratten auf, und der 5,18 Monofilament fällt in der Mitte des Bereichs.
6. Wenden Sie keine Monofilament während eine Ratte friert, hockt oder nicht essen. Wenn der Tester wartet, manchmal werden diese Bedingungen zu lösen und Prüfung wieder aufgenommen werden kann. Wenn die Ratte zeigt diese Verhaltensweisen und der gesamten Zeit in der AppAratus beträgt 20 Minuten, beenden Sie den Test und Retest von Anfang an am nächsten Tag. Entfernen Sie nicht die Ratte, während es angezeigt wird, diese Verhaltensweisen als diese ihr Auftreten erhöhen kann. Warten Sie, bis die Ratte bricht aus dieser Muster vor dem Umgang mit es zu vermeiden, verstärkt diese Verhaltensweisen.
7. Berühren Sie das Monofilament auf der L5 plantare Dermatom der Hinterpfote zwischen den Ballen, bis er beugt sich (siehe Abbildung 1A). Diese glatte stetige Anwendung sollte ca. eine Sekunde Zeit nehmen Sie sie dann aus der Haut. Vermeiden Sie jegliche Berührung des Fußes Pads als die Empfindlichkeit der Haut ist viel niedriger in diesen Bereichen. Dies stellt eine Single-Touch-Studie.
8. Eine positive Reaktion tritt auf, wenn die Ratte schnell hebt die Pfote bis vom Monofilament. Der Widerruf muss zum Zeitpunkt der Monofilament wird entfernt eingeleitet werden, um zu bestätigen, dass die Antwort mit dem Monofilament-Anwendung zugeordnet ist.
9. Sehen Sie sich das Tier für andere Anzeichen von Bewusstsein für die monofilament Touch wie Stimmgebung und schaute nach unten, hinten oder an der Pfote getestet, Lecken der Pfote, Tatze anhaltenden Rückzug oder Zucken der Ohren. Beachten sie auf dem Datenblatt. Wenn diese Verhaltensweisen mit Zurückziehen der Pfote treten sie dient als Beweis für die supraspinale Wahrnehmung des Reizes.
10. Wenn es eine positive Antwort, wenden Sie den nächst niedrigeren Monofilament. Wenn es keine Antwort gibt (negativ), den Aufstieg in die nächst höhere Monofilament. Warten Sie 30 Sekunden zwischen den einzelnen Monofil Anwendung für die sensorischen Rezeptoren, zurückzukommen zu den Ausgangswerten Abfeuern weitere Versuche (um eine Anpassung zu verhindern).
11. Weiterhin anwenden höher oder niedriger Monofilamente der Hinterpfote auf positive oder negative Reaktionen basieren, bis Sie 10 Versuche haben. Dann auf der anderen Hinterpfote zu wiederholen. (Siehe Beispiel-Datenblatt).
12. Die höchste VFH, die ohne die Einführung propriozeptiven Input und Heben der Pfote getestet werden kann, ist 6,10. Die 6.45VFH und größeren sollte nicht verwendet werden, weil die Pfote hebt vor dem monof werdenilament Kurven. Wenn es keine Reaktion bei 6,10 dann die nächste Studie wird die 6,10 wieder anzuwenden.
13. Eine Antwort sollte entleert werden und der Prozess muss wiederholt werden, wenn eine der folgenden tritt während der Stimulus-Anwendung oder Zurückziehen der Pfote:
    1. Die Ratte wird nicht kontinuierlich essen.
    2. Die Ratte bewegt sich weg von der VFH Impulse vor dem Biegen des Monofilamentes, was es unmöglich macht, um die Kraft, die den Abzug Reaktion auslöst kennen.
    3. Die Pfote wird durch die VFH (entweder vor oder nach dem VFH gebogen ist) Bereitstellen neben taktile Stimulation propriozeptiven angehoben.
14. Ein Test-Session kann in der Regel in weniger als 15 Minuten für beide Hinterbeine abgeschlossen sein.

C Datenverarbeitung für die UP-DOWN-ANSATZ

1. Ein erfolgreicher Test wird 10 aufeinanderfolgenden Versuchen für jede Pfote haben.
2. Der Wert der taktilen Schwelle ist die niedrigste Monofilament, die Pfote auf Entzug & G produzierte, 50% der Vorträge und Präsentationen 3 oder mehr des monofilen gegeben haben (siehe zB Datenblatt, Schwellen sind eingekreist) werden.
3. Ein Monofilament mit insgesamt nur 2 Studien nicht als Schwelle auch dann, wenn ein Versuch ist positiv und ein negativ ist ausgewählt. Mehrere Präsentationen des Reizes sind bessere Indikatoren der Muster der Antworten auf diese Kraft.
4. Wenn es keine Monofilament, die positiven Reaktionen erzeugt auf mindestens 50% der Tests, wird die Ratte einen Wert von 6,45 gegeben. Dies bedeutet, dass die Ratte nicht erkennen die höchste prüfbare Monofilament von 6,10 über Zufall. Ein Wert von 6,45 gegeben ist, weil es den nächsten Wert höher als der prüfbaren Bereich von Monofilamenten darstellt.
5. Konvertieren Sie den Schwellenwert für den rechten und linken Pfoten in Gramm Kraft. Die Gramm-Kraft-Werte werden von dem Lieferanten der von Frey Haaren versehen werden. . Für Daten aus bilateralen Verletzungen kann die Schwelle Gramm Kraft für die beiden Pfoten zusammen gemittelt werden nachgebeneine einzige Punktzahl.

2. Dorsal Von-Frey-Testing

Der Zweck dieses Tests ist es, taktile Sensibilität bei Ratten mit so schlechten motorischen Kontrolle, dass sie nicht getestet mit den typischen plantare VFH Methoden zu bestimmen. Sie quantifiziert, wie viel Kraft Touch benötigt wird, um ablehnende Haltungen hervorgerufen. Um Antworten auf propriozeptive Reize zu vermeiden, haben wir nicht zählen Studien, in denen die Pfote von der VFH während der Applikation bewegt wird. Darüber hinaus wissen wir nicht gehören Studien, in denen die VFH rutscht oder wird über die Dorsalfläche des Fußes gebürstet.

A. VERFAHREN Akklimatisierung für die dorsale von-Frey-TESTS

1. Sanfte Ratten für vier Sitzungen von jeweils 10 Minuten vor der Baseline-Tests und Verletzungen des Rückenmarks.
2. Lose wickeln die Ratte in einem kleinen Handtuch, damit die Hinterhand, wie unten (Abbildung 1B) gezeigt ausgesetzt sind. Positionieren Sie die Ratte über einen Tisch mit den Hinterpfoten leicht ruht auf der Oberfläche. Verwenden Sie die gleichegemütlich, aber nicht eng wickeln und halten für jede Ratte. Bracing Ihrem Unterarm am Rand des Tisches kann verringern Variabilität zwischen den Ratten.
3. Ein gentled Ratte, die zum Testen bereit ist, wird nicht widerstehen, die in das Handtuch für mehrere aufeinander folgende Minuten gehalten, allerdings müssen Sie möglicherweise neu umbrochen die Ratte 1 oder 2 mal bei der Prüfung von beiden Hinterpfoten.

B. TESTVERFAHREN für die dorsale von-Frey-TESTS

1. Wirf einen Würfel zu bestimmen, welche Hinterbein zu dem Testen beginnen zuerst. Auch Zahlen stehen für die rechte Pfote und ungerade Zahlen stehen für die linke.
2. Lose wickeln die Ratte das Handtuch Verlassen der Hinterhand ausgesetzt.
3. Taktilen Reiz wird nur angewendet, nachdem die Ratte ruhig und still für mindestens 10 Sekunden lang ist.
4. Beginnend mit dem 4,56 VFH, gelten die Monofilament senkrecht zur dorsalen Oberfläche zwischen der ersten und zweiten Mittelfußknochen etwa 1 cm oberhalb des Gelenks (1C). Wenden Sie das Monofilament in einem glatten, SteAdy Weise über einen 1 Sekunden Intervall, bis er biegt dann abziehen. Dies stellt eine Single-Touch-Studie.
5. Eine positive Reaktion tritt auf, wenn die Ratte schnell bewegt sich die Pfote weg von dem Stimulus. Die Richtung der Bewegung ist oft posterior oder externe bevor die hinteren Gliedmaßen gebogen wird. Der Widerruf muss zum Zeitpunkt der Monofilament wird entfernt eingeleitet werden, um zu bestätigen, dass die Antwort mit dem Monofilament-Anwendung zugeordnet ist.
6. Wenden Sie das 4,56 Monofilament noch zweimal mit mindestens 30 Sekunden zwischen den Anwendungen, um sensorische "Uhrwerk" zu verhindern und damit die sensorischen Rezeptoren, zurückzukommen zu den Ausgangswerten Brennen weitere Versuche (um eine Anpassung zu verhindern).
7. Ein Reiz, wenn der Test sollte VFH schlüpft erneut angewendet werden und streift sanft die Haut, macht die Kraft Lieferung mehr von einem Streichen oder eines Sweeps statt einem spitzen Kontakt.
8. Wenn es weniger als 2 (dh 1 oder 0) positiven Reaktionen auf 4,56 Monofilament sind, wird die nächst grössere VFH 3 aufgebrachtZeiten in der gleichen Weise.
9. Auf diese Weise werden zunehmend größere VFHs von 4,56 bis 5,88 angelegt, bis zwei oder mehr positive Reaktionen auftreten, oder bis der größte VFH erreicht ist.
10. Die Pfote Rücknahmeschwelle ist die niedrigste VFH, die mindestens 2 positive Reaktionen hervorruft von 3 Studien.
11. Wiederholen Sie auf der anderen Pfote.
12. Ein Test-Session kann in der Regel innerhalb von 15 Minuten für beide Hinterpfoten abgeschlossen sein.

3. Repräsentative Ergebnisse

Ein erfolgreicher Test wird in der unmittelbaren, lebhaften Rückzug der Hinterpfote auf eine senkrecht aufgebracht VFH bis zur Mitte des plantaren Region (Abbildung 1A) oder der dorsalen Fläche zwischen dem ^1. und ^2. Mittelfußknochen 1 cm aus dem Gelenk (Abbildung 1C) führen . Diese Antworten werden zusammengezählt abzuleiten taktile Schwelle für jede Hinterpfote. Taktile Schwellen von dorsal VFH Tests bei akuter SCI zeigten eine ausgezeichnete Treue, mit plantaren VFH Schwellen ableitend bei chronischen Zeiten (Abbildung 2). Rückgänge in taktile Schwellen von plantar oder dorsal Tests abgeleitet auftreten abgestufte für SCI (Abbildung 3 ^3,5). Diese Überempfindlichkeit zeigt bereits 7 Tage nach der SCI und wird für die Dauer des Experiments ^3-4,6 gehalten. Während eine Reihe von SCI Schweregrade nicht beeinflussen taktilen sensorischen Schwellen der Pfote, auftreten Rückgänge in Schwellen für schwerere SCI (Abbildung 3). Wichtig ist, dass die Entwicklung von unter-Level-Allodynie ein Alles-oder keine Antwort, wenn es einen Verlust von mehr als 60% der weißen Substanz an der Läsion Epizentrum auftritt. (4 ^3).

Taktile Schwellen können zerfallen und zu produzieren künstliche Reaktionen auf niedrige VFH Kräfte. Mindestens zwei Bedingungen produzieren können Schwelle Zerfall - schnell Auftragen der VFH auf die Haut in einem Stossen oder stechender Art und Weise oder wartet nicht lange genug zwischen Reiz-Anwendungen. Um sicher sein, dassdie taktile Schwellen sind echte, muss darauf geachtet werden, um jede VFH mit einem ähnlichen Ansatz mit niedriger Geschwindigkeit und die Interstimulusintervall muss mindestens 30 s betragen anzuwenden. Wir haben auch gezeigt, dass das Essverhalten reduziert Schwelle Zerfall ^5.

Abbildung 1. Schematische und Fotografie, die den Speicherort der VFH Stimulation für die Plantar-und Dorsalflexion von-Frey-Haar (VFH) Tests. A) Für plantare VFH Tests, sollte die von Frey Haare senkrecht zur Mitte der plantare Hinterpfote ca. 1 cm hinter der Mitte Phalanx (wie durch die rote Box in der Darstellung der Fußsohle der Hinterpfote angegeben) in einem langsamen angewendet werden konstante Geschwindigkeit, bis er Kurven. B und C) für die dorsale VFH Technik wird die Ratte lose in einer chirurgischen Handtuch gewickelt, wie in der Fotografie dargestellt. Die VFH ist mit der dorsalen Fläche der Pfote zwischen dem ersten und zweiten Mittelfußknochen approximatel angewendety 1 cm proximal des Gelenks.

Abbildung 2. Dorsal von Frey Haare sensorischen Schwellen korrelieren mit Standard-plantare VFH. (N-44; Pearson-Koeffizient = 0,503, p <0,01, r2 = 0,67). Die gestrichelten Linien zeigen die Cutoff-Schwelle für allodynischen Sensation entweder mit dem Dorsal VFH oder die plantare VFH Techniken und zeigen, dass allodynischen Schwellen auf 7 Tage nach der SCI mit dem Dorsal VFH Test chronischen unten-Ebene Allodynie durch plantare VFH Methoden bestimmt vorhersagen.

Abbildung 3. Frühe dorsal von Frey Haare sensorischen Schwellen voraussagen allodynischen und Nicht-allodynischen Tastgefühl über Verletzungen Schweregrade zu späteren Zeitpunkten. Vergleichbare sensorische Schwellen zwischen 7 Tage nach der SCI Dorsal VFH und 28 Tage nach der SCI plantare VFH Maßnahmen aufgetreten. Bemerkenswerte Ähnlichkeit eingetreten ist, für ein breite Palette von SCI, mit erheblichen Allodynie notierte in mittelschweren bis schweren SCI (p <0,05 vs 1,1 mm Verschiebung aller anderen Gruppen).

Abbildung 4. Prozentsatz der Ratten, die Laminektomie (kein SCI) und SCI-Gruppen zeigen Hinterpfote Allodynie zu 6 Wochen nach der SCI. Allodynie wurde nur bei Ratten mit mäßiger oder schwerer SCI (OSU ESCID Gerät 0,9, 1,1, 1,25, 1,3 mm Kabel Verschiebungen), während Ratten mit leichter SCI (0,3, 0,5, 0,7 mm Rückenmark Verschiebungen) zeigte normale Reaktionen auf taktile Stimulation gesehen. Vertreter koronalen Rückenmark Abschnitte für Myelin an der Läsion Epizentrum für Laminektomie (unverletzten Kontrolle) angefärbt, mild (0,5 mm Verschiebung) sind moderat (1,1 mm Verschiebung) und schwerer (1,3 mm Verschiebung) des Rückenmarks Prellungen enthalten, um den Grad der axonalen zeigen schonen, der mit dieser Überempfindlichkeit assoziiert. (Maßstab = 0,5 mm).

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Abbildung 5. Eine Stichprobe Datenblatt für up-down von Frey Haare Testen. Das Haar-Wert und das Ergebnis (positiv oder negativ) werden für jeden Versuch aufgezeichnet. Hinweise auf supraspinale Bewusstsein für die Prüfung werden zur Kenntnis genommen. Am Ende des Tests werden die Antworten an jedem Haar Wert ausgezählt. Der gewählte Schwellenwert für den Beispieldaten ist eingekreist.

Diskussion

Die VFH Testmethoden hier vorgestellten Tests repräsentieren zwei Paradigmen, die sensible und gültig für den Einsatz in Ratten-SCI-Modelle sind. Wichtig ist, dass die dorsale VFH-Test zur Beurteilung der Erholung der Tastempfindung der Hinterpfoten akut nach mittleren thorakalen SCI bei Ratten nicht in der Lage, sich auf ihre Hinterläufe stehen, sind geschaffen. Diese Tests Paradigma kann auch verwendet werden, wenn Ratten in der Lage, ihr Gewicht zu unterstützen und für die Hinterbeine nach zervikaler SCI wiederzuerla...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Semmes-Weinstein Monofilamente	Stoelting Co	58011
Fisch-Züchter-Box	Aquarium Supply Store		Hole in Seite für Getreide Lieferung gebohrt
Erhöhte Drahtgeflecht (1/4 "X 1/4"-Raster)	Eisenwarengeschäft
Elastische zu Fischzüchter Kasten in Position zu halten	Craft Shop
Gezuckerte Cerealien	Lebensmittelgeschäft
Chirurgische Huck Handtuch 16 "x 23"	Sanitätshaus