Induktion einer Verletzung des Nervus fibularis bei einer Maus zur Untersuchung der Regeneration neuromuskulärer Verbindungen

Zusammenfassung

Quelle: Dalkin, W., et al. Die Methode zur Verletzung des Nervus fibularis: Ein zuverlässiger Assay zur Identifizierung und zum Test von Faktoren, die neuromuskuläre Verbindungen reparieren. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt ein chirurgisches Verfahren zur Induktion einer Fibulausverletzung bei einer Maus, um die Regeneration der neuromuskulären Verbindung (NMJ) zu untersuchen. Bei diesem Verfahren wird der Nervus fibularis freigelegt, kontrollierter Druck ausgeübt, um eine Verletzung herbeizuführen, und sichergestellt, dass das Epineurium intakt bleibt, um die axonale Regeneration zu unterstützen. Im Laufe der Zeit beseitigen Makrophagen axonale Trümmer, was die Nervenreparatur und die Wiederherstellung von NMJs erleichtert.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Vorbereitung der Tiere auf die Operation

1. Betäuben Sie Mäuse mit einer Mischung aus Ketamin (90 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) durch subkutane Leisteninjektion mit einer sterilen 1-ml-Insulinspritze. Die Trägerlösung enthält eine Mischung aus 0,9 % Kochsalzlösung, 17,4 mg/ml Ketamin und 2,6 mg/ml Xylazin. Setzen Sie die Tiere wieder in Käfige, während Sie darauf warten, dass die Medikation wirkt.
   HINWEIS: Wenn die Aufsättigungsdosis für die Dauer des Eingriffs keine ausreichende Anästhesie bietet, können zusätzliche 25 % der Aufsättigungsdosis injiziert werden.
2. Überwachen Sie die Tiere nach der Injektion, um zu überprüfen, ob die Atemfrequenz gleichmäßig ist und das Erregungsniveau angemessen sinkt. Überprüfen Sie den Erregungsgrad mit einem Kneifen des Hinterfußes, der bei ausreichender Betäubung keine Reaktion hervorrufen sollte.
   HINWEIS: Dies dauert normalerweise 3-5 Minuten für eine junge erwachsene Maus mit durchschnittlich 25 bis 30 g. Wenn das Tier 10 Minuten nach der Injektion immer noch ansprechbar ist, können zusätzliche 25 % der Anästhesieaufsättigungsdosis injiziert werden.
3. Tragen Sie Vaseline und leichte Mineralöl-Augensalbe auf die Augen des Tieres auf, um Trockenheit zu vermeiden. Nehmen Sie die Tiere aus dem Käfig und legen Sie sie auf eine saubere, ebene Fläche. Rasieren Sie die gewünschte hintere Gliedmaße vom Fuß bis zum Becken mit einem elektrischen Haarschneider und legen Sie nur den seitlichen Aspekt der Gliedmaße frei.
4. Tragen Sie einen chemischen Haarentferner 1 Minute lang auf die rasierte Stelle auf. Entfernen Sie die Haare manuell mit Labortüchern. Reinigen Sie den enthaarten Bereich mit einem in Ethanol getränkten Labortuch.

2. Chirurgischer Eingriff

1. : Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente im Autoklaven oder auf eine andere geeignete Weise. Reinigen Sie das Operationsfeld und die Operationsplatte mit 80 % Ethanol/H₂O. Desinfizieren Sie das Operationsfeld mit Providon. Platzieren Sie die Maus auf der Operationsplatte und richten Sie sie an den Gliedmaßenfesseln aus. Halten Sie die Zielhintergliedmaße in einer anatomisch natürlichen Position mit leicht gestrecktem Kniegelenk ohne Innen- oder Außenrotation.
2. Legen Sie das Tier und das Brett unter das Operationsmikroskop. Orientieren Sie sich an der richtigen Inzisionsstelle, indem Sie oberflächliche Orientierungspunkte abtasten, insbesondere das knöcherne Kniegelenk und den Kamm zwischen dem Musculus tibialis anterior und dem Musculus gastrocnemius.
3. Machen Sie mit einem Skalpell oder einer Federschere einen ca. 3 cm langen Schnitt durch die Haut und greifen Sie dabei mit einer allgemeinen Pinzette. Machen Sie den Schnitt senkrecht zum darunter liegenden Verlauf des Nervus fibularis.
4. Setzen Sie den Schnitt durch die oberflächliche Faszie fort und legen Sie den Musculus biceps femoris und den Vastus lateralis frei. Trennen Sie diese Muskeln, indem Sie die verbindenden tiefen Faszien durchtrennen. Ein Schnitt von 1-2 cm sollte ausreichend sein.
5. Ziehen Sie den Musculus biceps femoris mit mechanischen Retraktoren kaudal zurück und legen Sie den Nervus fibularis communis frei.
6. Verfolgen Sie den Nerv proximal, bis sein Schnittpunkt mit der Sehne des lateralen Kopfes des Musculus gastrocnemius gefunden wird.
   Hinweis: Die Exposition kann eine zusätzliche Manipulation der zurückgezogenen Haut und des Muskels erfordern. Diese Kreuzung wird als stabiler Orientierungspunkt für Nervenverletzungen verwendet.
7. Fassen Sie den Nerv mit einer feinen Pinzette und richten Sie die Spitzen parallel zum lateralen Rand der Gastrocnemiussehne aus. Zerquetschen Sie den Nervus fibularis, indem Sie 5 Sekunden lang gleichmäßigen, harten Druck ausüben.
8. Bestätigen Sie die vollständige Quetschung des Nervs durch visuelle Inspektion durch das chirurgische Zielfernrohr. Es erscheint an der Verletzungsstelle durchscheinend. Wenn Mäuse verwendet werden, die Fluoreszenzproteine in peripheren Axonen exprimieren, verschwindet die Fluoreszenz von der Verletzungsstelle.
9. Entfernen Sie Retraktoren und richten Sie die Muskeln in ihren anatomischen Positionen neu aus. Verschließen Sie die Inzisionsstelle mit 6-0 Seidennähten. 1-3 einfache unterbrochene Nähte sind ausreichend. Legen Sie die Rekuperationsmaus auf ein Heizkissen in einem sauberen Käfig.
10. Überwachen Sie alle Tiere 2 Stunden nach der Operation, um die Atmung und etwaige Nebenwirkungen der Anästhesie zu überprüfen. Verabreichen Sie unmittelbar nach der Genesung von der Operation eine Anfangsdosis von Buprenorphin 0,05-0,10 mg/kg über subkutane Leisteninjektion. Verabreichen Sie in den nächsten 48 Stunden alle 12 Stunden 3 zusätzliche Dosen. Geben Sie die Mäuse nach vollständiger Genesung an die Tierpflegeeinrichtung zurück.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ketamine	VetOne	501072
Xylazine	Lloyd Inc.	3437
Buprenorphin	Zoopharm	1Z-73000-150910
Nair
Kim-Tücher	Kimtech	34155
Elektrorasierer	Braintree Scientific	CLP-64800
EtOH/H₂O
10% Proviod
1 ml Insulinspritze
Federschere	Vannas	91500-09
Nr. 15 Skalpell	Braintree Scientific	SSS 15
#5 Pinzette	Dumont	11252-00
6-0 Seidennaht auf umgekehrter Schnittnadel	Naht Express	752B
Nagetier-Heizkissen	Braintree Scientific	AP-R-18.5
Alexa 555 konjugierte alpha-BTX	Molekularsonden	B35451
Vectashield	Vector Labs	H-1000
Olympus Stereo Zoom Mikroskop	Olympus	562037192
Zeiss 700 Konfokalmikroskop	Zeiss
Perfusionspumpe mit variablem Durchfluss	Fisher Scientific	13-876-3

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