Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Akute Gewebeschnitt Vorbereitung

Zusammenfassung

Bei Mäusen ist die Fähigkeit, Pheromone erkennen hauptsächlich durch die Vomeronasalorgan (VNO) vermittelt. Hier ist eine akute Gewebeschnitt Vorbereitung der VNO für die Durchführung von Kalzium-Imaging beschrieben. Dieser physiologische Ansatz ermöglicht Beobachtungen von Subpopulationen und / oder einzelner Neuronen in einem lebenden Gewebe und ist für Rezeptor-Ligand-Identifikation bequem.

Zusammenfassung

Peter Karlson und Martin Lüscher den Begriff Pheromon zum ersten Mal in 1959 ¹ gegen Chemikalien für den Intra-Spezies-Kommunikation verwendet zu beschreiben. Pheromone sind flüchtige oder nichtflüchtige kurzlebige Moleküle ² sezerniert und / oder enthalten in biologischen Flüssigkeiten ^3,4, wie Urin, einer Flüssigkeit bekannt, dass eine Hauptquelle der Pheromone ³ sein. Pheromone Kommunikation ist in einer Vielzahl von wichtigen Tier-Modalitäten wie kin Interaktionen ^5,6, hierarchischen Organisationen ³ und sexuelle Interaktionen ^7,8 verwickelt und sind somit direkt mit dem Überleben einer bestimmten Art ^9,10,11 korreliert. Bei Mäusen ist die Fähigkeit, Pheromone erkennen hauptsächlich durch die Vomeronasalorgan (VNO) ^10,12, einem gekoppelten Struktur an der Basis der Nasenhöhle befindet vermittelt, und in eine knorpelige Kapsel. Jeder VNO hat eine Röhrenform mit einem Lumen ^13,14 sodass der Kontakt mit den externenchemischen Welt. Die sensorische Neuroepithel besteht im Wesentlichen aus vomeronasalen bipolaren sensorischen Neuronen (VSNs) ¹⁵ zusammen. Jeder VSN erstreckt sich eine einzelne Dendriten zum Lumen, in eine große dendritische Knopf trägt bis zu 100 Mikrovilli in chemischen Nachweis ¹⁶ verwickelt. Zahlreiche Subpopulationen von VSNs vorhanden sind. Sie werden von den Chemorezeptoren sie ausdrücken, und damit möglicherweise durch den Liganden (n) sie erkennen, ^17,18 differenziert. Zwei wesentliche vomeronasalen Rezeptor Familien, V1Rs und V2Rs ^19,20,21,22 sind jeweils um 240 ²³ und 120 ²⁴ Mitgliedern zusammen und werden in getrennten Schichten der Neuroepithel ausgedrückt. Olfaktorische Rezeptoren (OR) ²⁵ und formyl Peptid-Rezeptoren (FPRs) ^26,27 sind auch in VSNs ausgedrückt.

Ob diese neuronalen Subpopulationen verwenden die gleiche Downstream-Signalweg zur Erfassung Pheromone, ist unbekannt. Trotz einer bedeutenden Rolle, die ein Kalzium-permeable Kanal gespielt werden (TrpC2) in den Mikrovilli der reifen Neuronen ²⁸ trpC2 unabhängige Transduktion Kanäle wurden ^6,29 vorgeschlagen. Aufgrund der hohen Anzahl von neuronalen Subpopulationen und die besondere Morphologie der Orgel, sind pharmakologische und physiologische Untersuchungen der Signalelemente in der VNO-Komplex.

Hier präsentieren wir eine akute Gewebeschnitt Vorbereitung der Maus VNO für die Durchführung von Kalzium-Imaging Untersuchungen. Dieser physiologische Ansatz ermöglicht Beobachtungen in der Natur eines lebenden Gewebes, der allgemeine oder individuelle Subpopulationen von VSNs zuvor mit Fura-2 Uhr, ein Calcium-Farbstoff beladen. Diese Methode wird auch für das Studium keine GFP-markierten Pheromonrezeptor bequem und eignet sich sowohl für die Verwendung von anderen fluoreszierenden Kalzium-Sonden. Als Beispiel verwenden wir hier eine VG Maus line ^30, in der die Übersetzung der Pheromon V1rb2 Rezeptor zur Expression von GFP durch eine polycistronischen Strategie verknüpft ist.

Protokoll

1. Dissection der Maus VNO

1. Verwenden erwachsenen Mäusen. Als Pheromon sensing in Multimodalitäten verwickelt ist, ist eine sorgfältige Unterscheidung zwischen Stämmen, Genotypen, Geschlechts und Alters wichtig und werden Ihre Ergebnisse beeinflussen. Hier wählen wir Erwachsenen VG Mäusen ³⁰ zuvor für die Identifizierung einer Pheromon-Rezeptor-Paar (2-Heptanon-V1rb2) ³¹ (Abb. 1A) verwendet.
2. Vor Beginn der Dissektion, bereiten Sie frisches kaltes künstliche Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit (ACSF; NaCl 118 mm, NaHCO ₃ 25 mM, D-Glucose 10 mM, KCl 2 mM, MgCl _{2 2} mM, NaH ₂ PO ₄ 1,2 mM, CaCl _{2 2} mM, pH 7,4) mit oxycarbon (95% O ₂ gesättigt: 5% CO _2). Dafür mischen alle ACSF Komponenten außer CaCl _2. Tränken Sie die Lösung direkt durch das Sprudeln es mit oxycarbon. Am Ende fügen Sie die CaCl ₂ und stellen Sie mit ddH ₂ 0 bis die gewünschte Lautstärke. Halten Sie das ACSF-Lösung auf Eis, bis use.
3. Euthanasie der Maus sollte vorzugsweise durch Genickbruch oder durch CO _2-Inhalation werden, kurz bevor das Experiment durchgeführt.
4. Schneiden Sie die Maus den Kopf. Legen Sie sie unter einem Binokular in kalten ACSF kontinuierlich oxycarbonated.
5. Schneiden Sie den Unterkiefer und die Position des Kopfes, um den Gaumen (Abb. 1B) zu visualisieren.
6. Machen Sie einen Schnitt horizontal in den oberen Teil des Gaumens (Abb. 1B) mit Mikro-Schere und entfernen Sie den Gaumen Membran mit mikrofeinen Pinzette. Hydrate und reinigen ausgesetzt Hohlraum mit ACSF (Abb. 1C).
7. Schneiden Sie den oberen und den unteren Teil der Nasenscheidewand (Abb. 1C). Zart-Extrakt der Nasenscheidewand mit dem VNO und legen Sie es direkt in ACSF auf Eis (Abb. 1D).
8. Separate vertikal die beiden Teile des VNO mit Mikro Pinzette und zart entfernen Knorpelkapsel der VNO (Abb.. 1E). Stellen Sie sicher, dass alle die knorpeligen Stücke entfernt werden.

2. VNO Gewebeschnitt Vorbereitung

Der VNO Gewebeschnitt Vorbereitung in diesem Abschnitt 2) beschrieben ist vor allem für Kalzium-Imaging Untersuchungen. VNO Scheiben können auch für immunohistostainings auf schwimmenden Scheiben verwendet werden, um die strukturelle Integrität des Gewebes (siehe Abschnitt 3) des Protokolls) zu überprüfen.

1. Bereiten niedrig schmelzenden Agar (3% in Standard-PBS) und Ihrem Arbeitsplatz. Sie werden ACSF, ein Mikrotom und unterstützt, Mikro Pinzette braucht, Einbettformen (22 x 22 x 20 mm), Präzisions-Reinigungstücher, Pinsel, Zellkulturplatten, Cyanacrylat Klebstoff, Eis und ein Thermometer.
2. Füllen Sie den Einbettform mit 3% niedrig schmelzenden Agar. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur nicht höher als 41 ° C, bevor Sie vertikal die kurz abgewischt VNO (Abb. 2A) in der Lage sein koronalen Schichten zu erhalten.
3. Legen Sie die Einbettform auf Eisfür 1 min bis zur Erstarrung und dann trennen sie von der Agar-Block. Schneiden Sie die Agar-Block in Form einer Pyramide und legen Sie sie mit Kleber auf der Mikrotom-Unterstützung (Abb. 2B).
4. Cut koronalen VNO Scheiben mit dem Mikrotom mit einer Geschwindigkeit von 0,5 mm / s, einer Amplitude von 0,7 mm und eine Dicke von 100 um in kalten ACSF und sammeln Sie die Gewebeschnitte mit einer Bürste, bevor Sie sie in einer Gewebekultur Platte mit kaltem gefüllt ACSF.
5. Wenn Ihre Scheiben endogene Fluoreszenz wie GFP (in Gen-gezielte Neuronen) enthalten, können Sie sie unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop (Abb. 2C) zu wählen.

3. Immunhistochemie auf VNO schwimmende Scheiben

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, die Integrität des VNO Gewebeschnitten in Abschnitt 2) erhaltenen zu überprüfen. Acetyliertes-Tubulin ist ein Mikrotubuli / Zytoskelett-Marker in Dendriten und Mikrovilli der VNO sensorischen Neuronen exprimiert. Für Kalzium-Imaging Experimente, gehen RichtungTLY § 4) des Protokolls. Die immunhistochemischen Methode auf schwimmenden VNO Scheiben kann die Auswertung des Ausdrucks eines Proteins von Interesse angepasst werden. Zu diesem Zweck empfehlen wir Ihnen, fixieren die VNO für 1h bei 4 ° C in einer Fixierlösung (Paraformaldehyd 4% in PBS, pH 7,6) nach dem Punkt 1.7) des Protokolls und die Nutzung von diesem Punkt PBS bei pH 7,6 statt ACSF-Lösung.

1. In der Gewebekultur Platte, fixieren Sie Ihre Scheiben Interesse an einer Fixierlösung (Paraformaldehyd 4% in PBS, pH 7,6) 1h bei 4 ° C.
2. Block Ihrer Gewebeschnitte über Nacht bei 4 ° C in einer PBS-Lösung mit NGS (normal Ziegenserum) 10% und Triton X-100 bei 0,5%.
3. Inkubieren Scheiben mit dem primären Antikörper (anti-acetylierte-Tubulin, Maus, 1:2000) für 16h bei Raumtemperatur (RT) in einer PBS-Lösung mit 5% NGS und Triton X-100 bei 0,25%.
4. 3 x je 5 Minuten mit einer PBS-Lösung mit NGS 2%.
5. Inkubieren im Dunkeln mit dem secondary Antikörper (Cy5-konjugierten Ziege anti-Maus, 1:200) in einer PBS-Lösung mit NGS 2% für 1h bei RT.
6. 3 x je 5 Minuten mit PBS, das NGS 2% NGS PBS 1% und PBS nur.
7. Befestigen Sie Ihren Scheiben in einem fluoreszierenden Eindeckmittel (enthalten oder nicht DAPI), indem Sie sie in der Mitte der hydrophoben abgegrenzten Zonen (mit einem hydrophoben Stift) und decken die Scheiben mit Deckgläsern.
8. Machen Sie Beobachtungen und Akquisitionen mit der konfokalen Mikroskopie und eine Software, mit 3D-Rekonstruktionen (Abb. 2D-F).

4. Kalzium-Imaging auf VNO Scheiben

1. Die folgenden Verfahren findet im Dunkeln statt. Inkubieren VNO Scheiben für 1 Stunde bei 37 ° C in einem Laden Lösung von kalt ACSF mit Fura-2AM (7 uM; Stammlösung von 1 mM in DMSO) komponiert und Pluronic 0,1% (w / v; Stammlösung bei 20% in ddH ₂ O).
2. Halten Sie die geladenen Scheiben auf Eis mit oxycarbonation bis zur Verwendung. Loaded Scheiben gehalten werden kann für sein3-4h.
3. Legen Sie die geladenen Scheiben mit einem Pinsel in einer Perfusionskammer mit ACSF und pflegen die Scheiben mit einem Gewebeschnitt Anker (Abb. 3A).
4. Legen Sie die Perfusionskammer auf der Bühne eines Kalzium-Imaging-Mikroskop (Abb. 3B) und kontinuierlich mit oxycarbonated ACSF perfuse bei RT. Die Temperatur kann mit der Verwendung eines bipolaren Temperaturregler angepasst werden.
5. Beobachtungen der geladenen VNO Scheiben (Abb. 3C-E) sind mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop durchgeführt, mit einem 25x-oder 63x Objektiv und einem kühlen SNAP-HQ-Kamera. Die Beleuchtung erfolgt sequentiell (340/380 nm) mit einem Polychromator Instrument gemacht und aufgezeichnet mit einer Rate von 5Hz. Gefilterte Emission bei 510 nm durchgeführt. Intrazellulären Calcium-Verhältnis ändert sich (AF = 340 nm/380 nm) werden mit einer entsprechenden Software überwacht.
6. Chemostimulation sollten nach Ihren eigenen experimentellen Zweck ausgewählt werden. Hier mit Infusionen von ACSF ein Pheromon mix (Isobutylamin, 2-Heptanon, 4-Heptanon, 2-Heptanol, pentylacetate, Dimethylpyrazin, α / β-Farnesen, 10 ^-6 M), 2-Heptanon (10 ^-6 M) oder frisch gesammelten männlichen und weiblichen (1: 1) Maus Urin (1:100) sind ³² durchgeführt. Perfusion von ATP (125 pM) wird als Lebensfähigkeit Test am Ende der Experimente verwendet werden (Abb. 3F) und sollte einen Anteil von etwa 80% lebensfähige Nervenzellen zeigen. Unter diesen Bedingungen können Scheiben bis zu 2 Stunden verwendet werden.
7. GFP-markierten Subpopulationen von sensorischen Neuronen werden durch spezielle Beleuchtung (hier die V1rb2 Ausdruck Neuronen) visualisiert und können genau analysiert werden (Abb. 3G-I).

5. Repräsentative Ergebnisse:

Um einen funktionellen Assay zu etablieren, um die multi duktionswegen statt in der Maus VNO oder neue Pheromon-Rezeptor-Paare identifizieren zu untersuchen, nutzen wir die VG-Maus-Linie (Abb. 1A (Abb. 1E), bereiten wir akute VNO Scheiben (Abb. 2C). Wir fixieren ein Bruchteil von ihnen, um zu überprüfen und zu validieren Gewebs Integrität der Vorbereitung, indem immunohistostainings gegen die acetylierten-Tubulin-Proteinen (Abb. 2D-F). Die andere Fraktion der Scheiben ist für Kalzium-Imaging-Experimenten verwendet. Dafür sind Scheiben mit Fura-2 Uhr morgens (Abb. 3C-E) geladen und der intrazellulären Calcium-Ebene der einzelnen Neuron ist als AF-Verhältnis (Abb. 3F) überwacht. Die Lebensfähigkeit der Neuronen wird durch Perfusion von ATP (125 pM), bewertet nach dem schnellen und vorübergehenden Anstieg der AF-Verhältnis zu erwarten ist (Abb. 3F). Urin wird eine wichtige Quelle von Pheromonen, Perfusion von frischenly gesammelt Maus Urin (1:100) wird als eine endogene Kontrolle verwendet. Es löst Kalzium Transienten in etwa 50% der aufgenommenen Neuronen (Zelle 1 und 2, Abb.. 3F). Unter GFP Beleuchtung, sind V1Rb2 positive Neuronen zu beobachten, und die Durchblutung seiner bekannten Pheromone Liganden, 2-Heptanon, initiiert zelluläre Aktivierung (Zelle 1, Abb.. 3I). Interessanterweise sind neuronale Aktivierungen auch in einem Bruchteil der Neuronen, die nicht exprimieren die V1Rb2 Rezeptor (GFP negativen Neuronen) (Zelle 2, Abb.. 3I), was die Komplexität der Pheromon-Codierung im VNO zu beobachten.

Abbildung 1. Dissection der Maus Vomeronasalorgan. (A) Eine Maus aus der VG Linie. (B) Nach der Euthanasie der Maus, ist die vollständige Kopf unter einem Binokular gelegt und der Unterkiefer ist entfernt, um den Gaumen zu visualisieren. Ein kleiner horizontaler Schnitt ist getan(Schwarz gestrichelte Linie). (C) Nach der Entfernung der Gaumen ist der Nasenscheidewand mit dem VNO gesäumt in der oberen geschnitten und der untere Teil (weiß gestrichelte Linien) zu VNO-Extraktion zu erleichtern. (D) Das VNO ist in ACSF-Lösung positioniert und voneinander getrennt (insert: höhere Leistung angesichts der beiden Teile). (E) Die knorpeligen Kapsel des VNO ist fein entfernt, und das VNO ohne Knorpelkapsel ist für den Rest der Experimente verwendet. Scale-Bars sind: BE, 1 mm.

Abbildung 2. Maus vomeronasalen akuten Scheibe Vorbereitung und Gewebs Integrität. (A) Die Maus VNO ist vertikal in einem Agar-3%-Lösung eingebettet. Die Temperatur des Agar muss kleiner sein als 41 ° C. (B) Die Agar-Block wird in Form einer Pyramide geschnitten und 100 um VNO Abschnitte (schwarz gestrichelte Linie) sind in ACSF generiert. (C) VNO Scheiben können unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop ausgewählt werden, um eine spezifische visualisierenBevölkerung von markierten sensorischen Neuronen. (DF) Gewebs Integrität kann durch immunohistostainings gegen die acetylierten-Tubulin-Proteinen, einer höheren Macht angesichts der V1rb2 Gen gezielte Neuronen zeigen die perfekte Konservierung des Präparates ausgewertet werden. Neuronen mit ihren langen Dendriten Erreichen der Oberfläche des Lumens (E) sowie der Ausdruck der strukturellen Protein in den dendritischen Knöpfen und Mikrovilli zu beobachten (F) sein. Scale-Bars sind: B, 5 mm; C, 60 pm, D, 40 um; EF, 20 mm.

Abbildung 3. Calcium Imaging und Pheromonwahrnehmung in vomeronasalen akuten Gewebeschnitten. (A) Nach einer Fura-2AM Ladephase sind VNO Scheiben in eine Perfusionskammer platziert und mit einer angepassten Anker (high power view) erhalten. (B) Die Experimente werden in den dunklen und VNO Scheiben durchgeführt werden kontinuierlich mit ACSF bei RT perfundierten mit einem Vakuum-System. Die Temperatur kann chos werdenen mit einer Temperatur-Controller-System durch eine bipolare Pelletier-Element und einer thermischen Sonde zusammen. Diese speziellen Experiment wurde bei RT durchgeführt. (CE) VNO Scheiben werden unter Hoffman Phasenkontrast (C, Hv) oder Fura 380 nm Beleuchtung vor (D) und während der neuronalen Aktivierung (E, hier mit ATP) zu beobachten. (F) Neuronale Lebensfähigkeit ist mit Perfusion von ATP (125 pM) ausgewertet. Hier ist chemostimulation mit Urin (Urin, 1:100) oder mit einer Mischung aus Maus Pheromone (mix ph., 10 ^-6 M) auf einem konstanten Volumenstrom von 165 ml / h. getan Intrazelluläre Calcium-Spiegel (AF) kann individuell für jede Zelle aufgenommen werden (Cell 1 bis 3). (G) A V1Rb2 Neuron visualisiert unter GFP-Beleuchtung (1). (H) Die Belastung dieses Neurons (1) sowie ein nicht-V1rb2 Ausdruck Neuron (2) angezeigt wird. (I) Die V1rb2 Neuron ist in der Lage, auf 2-Heptanon mit einem intrazellulären Calcium-Anstieg reagieren. Dies insbesondere nicht V1rb2 Ausdruck Neuron reagiert auch auf 2-Heptanon (Zelle 2). Scale-Bars sind: CE, 20 mm; GH,15 mu m; AF = 340 nm / 380 nm. (F und I) Dauer des Reizes Anwendung wird durch Balken unter jede Spur angezeigt. Die willkürliche Farbskala repräsentiert die Intensität der Fluoreszenz.

Diskussion

Die Kalzium-Imaging hier vorgestellte Methode ermöglicht zu erfassen, in einer akuten Scheibe Vorbereitung, die Pheromone Reaktionen der Maus VNO Neuronen. Mit diesem Ansatz ist Dissektion vom Tier auf den vomeronasalen Neuronen, mit etwas Übung leicht zu erreichen und bietet eine lange lebendes Gewebe Vorbereitung. Es ermöglicht zeitaufwendige Experimente wie pharmakologische Untersuchungen oder die Untersuchung der Pheromone Codierung. Mit dieser physiologischen Technik können große Populationen sowie präzise neuronale Subpopulationen gezielt analysiert werden. Darüber hinaus kann diese Methode leicht auf immunhistochemischer Ansätze oder Versuche an anderen Kalzium-Farbstoffen angepasst werden. Der Einsatz dieser kombinierten Methoden wird sicherlich ermöglichen die Identifizierung von neuen Pheromone Liganden für die vielen Waisen Chemorezeptoren in der Maus Vomeronasalorgan ausgedrückt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Adenosin-5'-Triphosphat Dinatriumsalz-Lösung (ATP)	Sigma-Aldrich	A6559-25UMO
Agar	Sigma-Aldrich	A7002-100G	Bevorzugt für die Immunhistochemie
Agar (niedrigschmelzende)	Sigma-Aldrich	A0701-25G	Vorzugsweise für Kalzium-Imaging
CL-100 Bipolar-Temperaturregler	Warner Instruments	W64-0352
Konfokalmikroskop	Leica Microsystems	SP5 AOBS
Cy5-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-175-071	Vor Licht schützen
DMSO (Dimethylsulfoxid)	Merck	317275-100ML
Einbettformen, Peel-A-Way	Polysciences	18646A-1	22 x 22 x 20 mm
Fluorescent Eindeckmittel (Vectashield mit DAPI, 10 ml)	Rectolab	H-1200
FURA-2AM	Teflabs	0103	Vor Licht schützen
Glisseal N (Vakuum Fett, 60 g)	Borer Chemie	Glisseal N
Großes Bad Aufzeichnung Kammer (RC-26G)	Warner Instruments	64-0235
MetaFluor (Software für Kalzium-Imaging; v.7.6.5.0)	Visitron Systems
Monoklonale Anti-Tubulin, acetylierend Maus-Antikörper	Sigma-Aldrich	T6793-.2ML
Normalem Ziegenserum (NGS, 10 ml)	Interchim	UP379030
Plattform für Kammern (P-1)	Warner Instruments	64-0277
Pluronic F-127, 2 g	Invitrogen	P-6867
Roti Coll (Dosierflasche, 10 g)	Carl Roth	0.258,1
SC-20 Dual In-line-Lösung Heizer / Kühler	Warner Instruments	W64-0353
Slice-Anker (SHD-26GKIT)	Warner Instruments	64-0266
Stereofluorescence Mikroskop	Leica Microsystems	MZ16FA
Super-PAP PEN (hydrophobenpen)	Pelco Internationalen	22309
Triton X-100	Fluka	93420-250ML
Vibrierender Klinge Mikrotom VT 1200S	Leica Microsystems	14048142066
VisiChrome hoher Geschwindigkeit Polychromator System	Visitron Systems
3D-Datenvisualisierung (Imaris; v.6.3.1)	Bitplane Scientific Software