Ein Modell von gequetscht Einseitige Cervical Spinal Cord Injury Mit dem Infinite Horizon Impactor

Zusammenfassung

Eine zuverlässige und wiederholbare Möglichkeit, eine zervikale einseitige Verletzung des Rückenmarks mit der Infinite Horizon Impaktor produzieren wird beschrieben. Die Methode nutzt die Vorteile eines maßgeschneiderten Rahmen und spannen, um die Wirbelsäule zu stabilisieren. Das standardisierte Verfahren und biomechanischen Parameter führen zu Verletzungen ausreichende und nachhaltige Verletzungen.

Zusammenfassung

Während die Mehrheit der menschlichen Verletzungen des Rückenmarks in der Halswirbelsäule auftreten, beschäftigt die große Mehrheit der Laborforschung Tiermodellen der Rückenmarksverletzung (SCI), in dem der thorakalen Rückenmarkes verletzt wird. Darüber hinaus, weil die meisten Menschen Schnur Verletzungen als Folge der stumpfen, nicht penetrierenden Verletzungen (z. B. Kfz-Unfall, Sportverletzung), wo das Rückenmark gewaltsam von Vertriebenen Knochen oder Weichteile geschlagen wird auftreten, sind die Mehrheit der SCI-Forscher der Meinung, dass die meisten klinisch relevanten Verletzungen Modelle, bei denen das Rückenmark gequetscht wird schnell sind. ¹ ist daher ein wichtiger Schritt in der präklinischen Evaluierung neuer Therapien auf dem Weg zum menschlichen Übersetzung eine Bewertung ihrer Wirksamkeit in einem Modell der Prellung SCI innerhalb der zervikalen Rückenmarks. Hier beschreiben wir die technischen Aspekte und die daraus resultierenden anatomischen und Verhaltensstörungen Ergebnisse einer einseitigen gequetscht Modell der Halswirbelsäule, die SCI beschäftigt dasInfinite Horizon Rückenmarksverletzung Impaktor.

Sprague Dawley Ratten wurden einer linksseitigen unilateralen Laminektomie an C5. Um die Reproduzierbarkeit der biomechanischen, funktionellen und histologischen Ergebnisse der Verletzung Modell zu optimieren, gequetscht wir das Rückenmark mit einer Schlagkraft von 150 kdyn, ein Aufprall Flugbahn von 22,5 ° (Tiere bei 22,5 ° gedreht), und eine Auswirkung Lage abseits der Mittellinie von 1,4 mm. Funktionelle Erholung wurde mit Hilfe des Zylinders Aufzucht Test, horizontale Leiter Test, Test und Pflege modifizierte Montoyas Treppenhaus Test für bis zu 6 Wochen, danach werden die Rückenmark wurden histologisch auf weißen und grauen Substanz schonende ausgewertet.

Die Verletzung hier vorgestellte Modell vermittelt konsistente und reproduzierbare biomechanische Kräfte auf das Rückenmark, ein wichtiges Merkmal eines experimentellen Modells SCI. Dies führt zu diskreten histologischen Schäden an der lateralen Hälfte des Rückenmarks, die sich im Wesentlichen auf t enthaltenener ipsilateralen Seite der Verletzung. Die Verletzung wird von den Tieren gut vertragen, führt aber zu funktionellen Defiziten der Vordergliedmaße, die signifikante und nachhaltige in den Wochen nach der Verletzung sind. Die zervikale einseitige Verletzung hier vorgestellten Modells können eine Ressource, um Forscher, die potenziell vielversprechende Therapien vor der menschlichen Übersetzung testen möchten sein.

Protokoll

1. Richten Sie: Rahmen und Design-Clamp zum Halten der Tiere

1. Der Rahmen und die Klammer um das Tier zu halten, war speziell entwickelt, um die Infinite Horizon (IH) Spinal Cord Injury Impactor unterzubringen.
2. Die Basis des Rahmens ist ein Aluminium-Plattform in den folgenden Abmessungen (30,2 cm x 20,3 cm x 1,3 cm), um in der Tabelle Führungsbügel, die serienmäßig mit dem IH-Gerät (Abbildung 1A) kommt zu passen geschnitten.
3. Vier Flexaframe Unterstützung Fußplatten (Fisher Scientific, Toronto, ON) werden auf die Plattform und acht Flexaframe Stützstangen (Fisher Scientific, Toronto, ON, 30,5 cm) werden mit Hilfe von acht Flexaframe Unterstützung Anschlüsse (Abbildung 1B) angebracht.
4. Zwei zusätzliche Unterstützung Flexaframe Anschlüsse, die an den mittleren zwei Stäbe, die custom made ​​Haus hält für die Klemme (Abbildung 1B).
5. Der Winkel, um das Tier Rückenmarks gedreht Bezug auf die Vertikale durch keepin eingerichtetg eines der horizontalen Stange an Ort und Stelle und das Verändern der Höhe der anderen horizontalen Stange (2).
6. Die Klemme ist 35,6 mm lang, 25,4 mm hoch und mit einem 7,6 mm Kiefer entwickelt, um starr festhalten unter dem Querfortsatz von C4 bis C6 (Abbildung 1C). Weitere Einzelheiten zu der Klemme Design wurden bereits von Choo et al., 2009.

2. Chirurgie

1. Männliche Sprague-Dawley-Ratten (Charles River Laboratories) mit einem Gewicht von 300-350 g wurden anästhesiert durch Isofluran (4% für die Induktion und 2% für die Wartung) in Sauerstoff (1 L / min).
2. Sobald die Tiere unter der Ebene der Anästhesie sind, wird das Tier in einen stereotaktischen Rahmen (Kopf, Tujunga, CA) angeordnet ist.
3. Um Blutungen während der Operation 0,4 ml Lidocain (20 mg / ml; Bimeda - MTC Animal Health Inc., Cambridge, Ontario, Kanada) zu minimieren mit Adrenalin intramuskulär wird rund um die Operationsstelle in der DORSA injiziertl Halsbereich.
4. Ein 4-5 cm dorsalen Mittellinie Einschnitt gemacht wird mit einem sterilen Skalpell (# 15), ausgehend von der Basis des Schädels und nach kaudal.
5. Sterile Pinzette Adson werden verwendet, um ohne Umschweife durch die Rückenmuskulatur, die Wirbelsäule zu sezieren, und eine sterile Alm Retraktor (Fine Science Tools, North Vancouver, BC) eingeführt wird, damit die Muskeln auseinander zu erreichen.
6. Mit dem Skalpell Nr. 15, die Muskeln, die über der Laminae von C4-C7 sind abgekratzt beginnend in der Mittellinie und fegt sie seitlich.
7. Ein Schnitt mit einem sterilen Skalpell (# 15) wird an den Muskel an den Querfortsätzen auf beiden Seiten der Wirbelsäule, um die Klemme unter den Querfortsätzen C4 bis C6 Passform.
8. Mit einem sterilen feinen kippte Friedman-Pearson Rongeur (Fine Science Tools, North Vancouver, BC), wird die linke C5 Lamina vorsichtig entfernt, um die Dura und das Rückenmark zu visualisieren.
9. Eine Stange mit einem Durchmesser von 1,5 mm unter den Armen geschobendas Tier zu stützen, wodurch sich die Wirbelsäule leicht und Erleichterung Klemme Insertion.
10. Montieren Sie den Unterkiefer des sterilen Klemme auf seitlichen Querfortsätze von C4-C6 und die Schrauben anziehen.
11. Entfernen Sie die Alm Retraktor.

3. Spinal Cord Injury

1. Nachdem die Klemme an dem Tier befestigt ist, wird das Tier in der IH Schlagkörper bewegt.
2. Die Klemme wird in die Metallträger auf den beiden mittleren Stäbe des Rahmens, die in einem Winkel von 22,5 ° von der Horizontalen (2) kontrolliert wurden, eingesetzt.
3. Die Scheren-Wagenheber, die stabil Höhenverstellung, (VWR, Mississauga, ON) stellt wird, bis das Tier flach aufliegt angehoben.
4. Stellen Sie sicher, dass die Klemme horizontal, indem Sie einen kleinen Zylinder Ebene auf der Oberseite der Klemme und durch Anziehen der Schrauben ist. Es ist wichtig, dass alle Schrauben fest angezogen sind und so ist die Einstellung starre ohne jede Bewegung.
5. Der Rest des Verfahrens wird unter einem Mikr durchgeführtOSCOPE (Leica MZ8).
6. Senken und zielen Sie mit dem Impaktor Spitze (15 mm Durchmesser, mit abgerundeten Kanten) mit Hilfe der vertikalen Einstellknopf und die beiden horizontalen Einstellknöpfe auf der IH Impaktor bis das Zentrum der Impaktor-Spitze über die Spitze des Dornfortsatzes C6 schwebt.
7. Sobald der Impaktor Spitze zentriert ist, drehen Sie den y-Achse Einstellknopf eins und zwei fünfte Zug (1,4 mm), um die Spitze seitlich zu bewegen, um die linke Seite und der x-Achse horizontal Einstellknopf, um den Impaktor Spitze des Zentrums von C5 zu bewegen.
8. Senken Sie die Spitze, bis er knapp über der Dura ist zu überprüfen, dass der Impaktor Spitze strebt die laterale Hälfte der grauen Substanz.
9. Drehen Sie den vertikalen Einstellknopf zwei wendet sich an die Spitze 4 mm über der Dura zu erhöhen.
10. Stellen Sie sicher, dass die Auswirkungen von trockenen Gebiet mit einem Wattestäbchen oder Stick ist.
11. Stellen Sie die gewünschte Kraft zu 150 kdyn auf dem Programm und klicken Sie auf "Start Experiment", um den Impaktor auslösen.
12. Nach der Verletzung, wird die Wunde in Laye geschlossenrs mit 5-0 Vicryl Nähte. Buprenorphin (0,03 mg / kg SC, Temgesic, Schering-Plough Corporation, Kenilworth, NJ) und Kochsalzlösung (10 ml) wird subkutan verabreicht und vor zweimal täglich für zwei Tage nach der Operation. Tiere sind eng zweimal pro Tag für 2 Wochen und einmal pro Woche für 6 Wochen nach der Verletzung überwacht.

4. Repräsentative Ergebnisse

Zwanzig Neun männliche Sprague Dawley-Ratten (Charles River Laboratories) mit einem Gewicht von 300-350 g wurden bei einer Kraft von 150 Einstellung kdyn verletzt. Der Stoßkörper Spitze wurde 1,4 mm lateral zur Mittellinie gerichtet, in einem Winkel von 22,5 ° von der Vertikalen. Die mittlere tatsächliche Kraft war 155,55 ± 0,73 kdyn. Die mittlere Verschiebung war 1512,72 ± 27,86 um und die Geschwindigkeit war 120,24 ± 0,52 mm / s (Abbildung 3).

Verhalten Outcome Measures

Funktionelle Erholung wurde anhand der horizontalen Leiter Test, Test-Zylinder-Aufzucht, Pflege-Test,und modifizierte Montoya Treppenhaus Test ^1. Die Tiere wurden vor der Verletzung ausgebildet und beurteilt 2, 4 und 6 Wochen nach der Verletzung. Es gab signifikante Beeinträchtigungen Vorderbein über den Versuchszeitraum entstanden sind.

Horizontale Ladder-Test. Vor der Verletzung, gemacht Tieren nur 4,75 ± 0,73% Fehler auf der ipsilateralen Vorderpfote beim Durchlaufen über die unregelmäßigen Abständen horizontale Leiter. Nach der Verletzung, zeigten die Tiere gekennzeichnet Anstieg des Prozentsatzes der Vorderpfote Fehler. Die ipsilateralen Vorderpfote Prozent Fehler waren 26,97 ± 2,92%, 26,23 ± 2,84% und 22,06 ± 2,05% bei 2, 4 und 6 Wochen nach der Verletzung (Abbildung 4A). Wichtig ist, dass die Vordergliedmaße Beeinträchtigung zu diesem Test für die 6 Wochen lang aufrechterhalten.

Zylinder Aufzucht Test. Der prozentuale Anteil der ipsilateralen Vorderpfote (links + beides) Nutzung während der Exploration deutlich zurückgegangen nach einer Rückenmarksverletzung.Vor der Verletzung, verwendet die Tiere die ipsilateralen Vorderpfote 75,12 ± 2,25%. Nach der Verletzung die Tiere nutzten die ipsilateralen Vorderpfote 8,59 ± 1,80% bei 2 Wochen, 14,25 ± 2,65% bei 4 Wochen und 11,76 ± 2,66% nach 6 Wochen (Abbildung 4B).

Geändert Montoya Staircase-Test. Die Zahl der Pellets mit der ipsilateralen Vorderpfote abgerufen dramatisch zurück nach der Verletzung. Vor der Verletzung, die Tiere gesammelt 84,85 ± 2,88% der Nahrung belohnt. Jedoch auf 2, 4 und 6 Wochen nach der Verletzung die abgerufenen Tiere nur 30,91 ± 4,03%, 28,94 ± 4,38% und 25,86 ± 3,09% der Pellets (4C).

Grooming-Test. Es gab eine drastische Verringerung der Fellpflege Scores nach der Verletzung. Nach SCI, waren die ipsilaterale Grooming Partituren 2 Wochen: 2,00 ± 0,17, 4 Wochen: 1,83 ± 0,17 und 6 Wochen: 1,79 ± 0,11 (FiguRe 4D).

Histologische Ergebnisse

Weißen Substanz und Grau Angelegenheit Sparing. Ein Beispiel für eine Verletzung des Rückenmarks mit einer Kraft von 150 kdyn, Winkel von 22,5 ° und Querrichtung Ziel von 1,4 mm wird in 5 dargestellt. Die Verletzung führte zu erheblichen Schäden an der grauen und weißen Substanz auf der ipsilateralen Seite. Sowohl kortikospinalen rubrospinale und Traktate wurden verletzt und 23 der 29 Tiere hatten Parenchymschädigung auf der ipsilateralen Seite enthalten sind. Die longitudinale Ausmaß der Schäden der weißen und grauen Substanz war 2400 und 2400 rostral nach kaudal (Abbildung 6). Beim Hinzufügen der Abschnitte, um eine grobe Schätzung des "kumulativen Ausbreitung" der weißen und grauen Substanz schonende (2000 um rostralen und kaudalen zum Epizentrum) bieten, hatte der ipsilateralen Seite nur 51,8% der weißen Substanz geschont und 39,7% der grauen Substanz übrigen auf der Gegenseite (Abb. 6) verglichen.

Abbildung 1. Infinite Horizon Rückenmarksverletzung Impaktor. A. Infinite Horizon Impaktor und insgesamt einzurichten. B. Frame einrichten. C. Close-up Bild von der Klemme zur Befestigung von Gebärmutterhalskrebs Querfortsätze. D. Spezifikation (Einheit: cm) der Klemme. Empfohlene Toleranz <0,002 in (Choo et al. 2009). Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 2. A. Illustration und entsprechenden Rahmen bis zu Rückenmark Drehung von 0 ° (neutral) oder B. 22,5 ° zu erreichen mit der seitlichen Ziel von 1,4 mm eingestellt.

Abbildung 3. Vertreter von Kraft und Weg Graphen für Infinite Horizon Impaktor. Der Pfeil indicates die Zeit, dass der Impaktor Spitze hat 20 kdyn und den Punkt, wenn die Aufzeichnung der Verschiebung initiiert erreicht ist. Die tatsächliche Kraft von der Spitze der Kraft-Zeit-Kurve abgelesen und die entsprechende Verschiebung berechnet wird. Die nachfolgenden Grafiken zeigen ein typisches 150 kdyn Prellung, Hubraum A.-Zeit-Graphen, B. Kraft-Zeit-Graphen. Diese Grafiken zeigen, dass die tatsächliche Kraft erreicht 152 kdyn, und der Impaktor Verschiebung war in die Schnur wurde gemessen, um 1287 um betragen. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 4. Behavioral Assessments für Kraft von 150 kdyn, Impaktor Winkelung von 22,5 ° und Ziel von 1,4 mm von der Mittellinie. A. links Horizontale Leiter Test. B. Zylinder Aufzucht Test. C. Modifizierte Montoya Treppenhaus Test. D. Grooming-Test. Die ipsilateralen Vorderpfote führte zu einer signifikanten und nachhalNed Beeinträchtigungen der kontralateralen Vorderpfote verglichen.

Abbildung 5. Repräsentative Bilder das verletzte Rückenmark von rostral nach kaudal 1600 um 1600 um.

Abbildung 6. Histologische Beurteilungen. A. Prozent weißer und grauer Substanz verschont. Materie um 2000 um die Epizentrum Schäden weitgehend verschont wurde. B. Kumulative weißen und grauen Substanz geschont 2000 um innerhalb des Epizentrums des Schadens. Der ipsilateralen Seite hatte deutlich weniger grauen und weißen Substanz im Vergleich zur kontralateralen Seite verschont. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .

Diskussion

In diesem Beitrag beschreiben wir eine einseitige zervikale Prellung Modell mit dem Infinite Horizon (IH) Impaktor mit einer Kraft von 150 kdyn ein Winkel von 22,5 ° aus der vertikalen und einer lateralen Ziel von 1,4 mm von der Mittellinie. Mit diesen Einstellungen konnten wir nachhaltige Verhaltensänderungen Defizite in der ipsilateralen Vorderpfote mit Parenchym enthaltenen Störung weitgehend auf der ipsilateralen Seite, wo es schien, dass erhebliche Schäden aufgetreten zu den Regionen, wo die rubrospinale, retikulos...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Bezeichnung des Geräts	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Infinite Horizon Impactor	Precision Systems und Instrumentierung	IH-0400
Aluminiumblech	Metalsupermarlets.com	APT6061/500
Flexaframe Unterstützung Fußplatten	Fishers Scientific	1466625Q
Flexaframe Stützstangen	Fishers Scientific	1466610GQ
Flexaframe Unterstützung Anschlüsse	Fishers Scientific	1466620Q
Spannen Sie ein	Custom made		Choo et al., 2009
Metall-Halter	Custom made		Siehe oben
Impactor Spitze	Custom made		Durchmesser: 1,15 mm
Stereotaktischen Rahmen	David Kopf Instruments	Modell 900
Zylinder-Ebene	Yijia TOOLS	YJ-SL0620
Mikroskop	Leica		Model #: MZ8
Labor Scherenheber	VWR	12620-902