Wir beschrieben ein Verfahren für die Zerlegung von Darmkrebs (CRC), lebensfähige einzelne Zellen, die dann auf kundenspezifische Antikörper Microarrays erkennen Oberflächen-Antigene (DotScan CRC-Microarray) erfasst zu produzieren. Sub-Populationen von Zellen gebunden, die Microarray kann durch Fluoreszenz-Multiplexing mit monoklonalen Antikörpern mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert profiliert werden.
Methodenartikel
Darmkrebs Zelloberflächenprotein Profiling mit einem Antikörper Microarray und Fluoreszenz Multiplexing
In diesem Artikel
Erratum-Hinweis
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die aktuelle Prognose und Klassifikation von CRC basiert auf Staging-Systeme, die histopathologischen und klinischen Befunden zu integrieren. Doch in der Mehrzahl der CRC Fällen ist Zelldysfunktion das Ergebnis zahlreicher Mutationen, die Protein-Expression und posttranslationale Modifikation 1 ändern.
Eine Reihe von Zell-Oberflächen-Antigene, einschließlich Cluster der Differenzierung (CD)-Antigene wurden als potenzielle prognostische oder metastasiertem Biomarker in CRC identifiziert worden. Diese Antigene bilden ideale Biomarker als ihren Ausdruck oft ändert sich mit Tumorprogression oder Wechselwirkungen mit anderen Zelltypen, wie zB Tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TIL) und Tumor-assoziierte Makrophagen (TAM).
Die Verwendung von Immunhistochemie (IHC) für Krebs sub-Klassifikation und Prognose ist gut für einige Tumorarten 2,3 etabliert. Es wurde jedoch keine einzige "Marker" prognostische Signifikanz gezeigt größer als klinisch-pathologischen Staging-oder gewonnen breite Akzeptanz für den Einsatz in der Routine-Pathologie Meldung aller CRC Fällen.
Ein neuerer Ansatz, um prognostische Stratifizierung Krankheitsphänotypen setzt auf Oberflächenprotein Profile mit mehreren "Marker". Während Expression Profiling von Tumoren mit Proteom-Techniken wie iTRAQ ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Entdeckung der biomarkers4, ist es nicht optimal für den routinemäßigen Einsatz in diagnostischen Laboratorien und kann nicht unterscheiden, verschiedene Zelltypen in eine gemischte Bevölkerung. Darüber hinaus werden große Mengen von Tumorgewebe für die Profilierung des gereinigten Plasmamembran Glykoproteine durch diese Methoden erforderlich.
In diesem Video haben wir beschrieben, eine einfache Methode zur Oberfläche Proteom-Profiling von lebensfähigen Zellen aus aufgeschlüsselte CRC-Proben mit einem DotScan CRC Antikörper Microarray. Die 122-Antikörper Microarray besteht aus einem Standard-82-Antikörper Region die Anerkennung einer Reihe von Lineage-spezifische Leukozyten-Marker, Adhäsionsmoleküle, Rezeptoren und Marker der Entzündung und Immunantwort 5, zusammen mit einem Satelliten-Region für den Nachweis von 40 potentiell prognostischer Marker für CRC . Die Zellen sind nur auf Antikörper, für die sie ausdrücken, das entsprechende Antigen erfasst. Die Zelldichte pro Punkt, durch optische Abtastung ermittelt, spiegelt der Anteil der Zellen, die das Antigen, das Niveau der Expression des Antigens und der Affinität des Antikörpers 6.
Für CRC Gewebe oder normalen Darmschleimhaut, spiegeln optische Scans der Immunphänotyp von gemischten Populationen von Zellen. Fluoreszenz-Multiplexing können dann verwendet werden, um ausgewählte Sub-Populationen von Zellen von Interesse auf dem Array erfasst Profil. Zum Beispiel, Alexa 647-anti-Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM, CD326) ist ein pan-epitheliales Differenzierungsantigen, die zur CRC-Zellen und auch Epithelzellen der normalen Darmschleimhaut erkennen war, während Phycoerythrin-anti-CD3, wurde verwendet, zu erkennen infiltrierenden T-Zellen 7. Das DotScan CRC Microarray sollte der Prototyp für eine diagnostische Alternative zu den anatomisch-basierte CRC Staging-System sein.
Protokoll
Abbildung 1. Arbeitsablauf für die Herstellung einer Suspension von lebenden Zellen aus einem chirurgischen Stichprobe von CRC.
1. Klinische Probe Disaggregation
Alle Proben wurden von der Royal Prince Alfred Hospital (Camperdown, NSW, Australien) und Concord Rückführung Hospital (Concord West, NSW, Australien) mit Einwilligung im Rahmen des Protokolls Nr. X08-164 gesammelt.
- Sammeln Sie frische Kolorektalkarzinom (CRC) oder Adenom Pr....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
In diesem Video zeigen wir, wie das DotScan Antikörper Microarray in einer einfachen, semi-quantitative Weg, um Oberflächen-Antigen-Profile für Zellpopulationen aus CRC Gewebe Studie verwendet werden kann.
Die Erteilung einer tragfähigen Einzel Zellsuspension aus Gewebe ist entscheidend für den Erfolg des Experiments, weil die Energie-abhängige Prozesse (zB, Antigen Begrenzung und / oder Pseudopodien-Bildung), für feste Bindung von ganzen Zellen zu Antikörper Punkte während der Inkubation er.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Wir danken Mitarbeiter am Anatomischen Pathologie Laboratories des Royal Prince Alfred und Concord Rückführung Krankenhäuser zum Sammeln frischer Proben von CRC und normalen Darmschleimhaut. Die Arbeit wurde durch einen Cancer Institute New South Wales Translational-Zuschüssen finanziert.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagens oder Ausrüstung | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare |
| Hanks 'balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6136-10X1L | Buffered mit 25 mM Hepes (Sigma # H3375) |
| Airpure biologischen Sicherheitswerkbank der Klasse II | Westinghouse | 1687-2340/612 | |
| Chirurgische Klingen | Livingstone | 090609 | Packung mit 100 Stück |
| RPMI 1640 mit 2 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R4130-10X1L | |
| Collagenase Typ 4 | Worthington | 4188 | |
| Deoxyribonuclease 1 | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Terumo Spritze (10 ml) | Terumo | MS +10 L | Box von 100 |
| Filcon Filter (200 um) | BD Biosciences | 340615 | |
| Filcon Filter (50 um) | Filcon Filter (50 um) | Filcon Filter (50 um) Filcon Filter (50 um) 340603 | |
| Fötalem Kälberserum | Gibco / Invitrogen | 10099-141 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 7017 | |
| Dimethylsulfoxid | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Trypanblau | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Hemocymeter Technocolor Neubar | Hirschmann | nicht verfügbar | |
| Lichtmikroskop | Nikon | Nikon TMS | |
| Cyrovial Rohre | Greiner Bio-One | 121278 | |
| Cryo Einfrieren contrainer | Nalgene | 5100-0001 | |
| DotScan Antikörper Microarray-Kit | Medsaic | nicht verfügbar | |
| DotScan Microarray Waschküvette | Medsaic | nicht verfügbar | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 4103 | |
| Formaldehyd 37% | Sigma-Aldrich | F1635-500ML | |
| DotReaderTM | Medsaic | nicht verfügbar | |
| Rinderserumalbumin | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
| Heat-inaktivierten AB-Serum 2% | Invitrogen | 34005100 | |
| Phycoerythrin-konjugierten CD3 | Beckman Coulter | ET386 | |
| AlexaFluor647-konjugierten EpCAM | BioLegend | 324212 | |
| Typhoon FLA 9000 | GE Healthcare | 28-9558-08 | 532 nm-Laser, 580 BP30 Emissionsfilter für PE. 633 nm-Laser und 670 BP30 Emissionsfilter für Alexa647 |
| MultiExperiment-Viewer v4.4 | TM4 Microarray Software Suite | Open - Source-Software (Ref 11) |
Referenzen
- Steinert, R., Buschmann, T., vander Linden, M., Fels, L. M., Lippert, H., Reymond, M. A. The role of proteomics in the diagnosis and outcome prediction in colorectal cancer. Technol. Cancer. Res. Treat. 1, 297(2002).
- Eifel, P., Axelson, J. A., Costa, J., Crowley, J., Curran, W. J., Deshler, A., Fulton, S., Hendricks, C. B., Kemeny, M., Kornblith, A. B., Louis, T. A., Markman, M., Mayer, R., Roter, D.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden
Genehmigung beantragenErratum
Formal Correction: Erratum: Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing
Posted by JoVE Editors on 7/03/2015. Citeable Link.
The author's email has been corrected in the publication of Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing. There was an error with the author, Jerry Zhou's, email. The author's email has been updated to:
j.zhou@uws.edu.au
from:
jzho7551@mail.usyd.edu.au