Multiplex Nachweis von Bakterien in komplexen Clinical and Environmental Proben mit Oligonukleotid-gekoppelten Fluoreszenz-Mikrosphären

Summary

Wir beschreiben ein Multiplex-Verfahren für den Nachweis von Mikroorganismen in einer Probe mit Oligonukleotid-gekoppelte fluoreszierende Kügelchen. Amplicon aus allen Organismen in einer Probe ist es, ein Gremium von Sonde-gekoppelten Beads hybridisiert. Ein Luminex oder Bio-Plex Gerät wird verwendet, um jede Perle für Perle Art und Hybridisierungssignal Abfrage.

Abstract

Bakterielle Vaginose (BV) ist ein immer wiederkehrendes polymikrobiellen Syndrom, das durch einen Wechsel in die "normale" Mikroflora von einer Mikroflora durch eine Reihe von Bakterienarten, darunter Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae dominiert Lactobacillus-dominiert, und andere ^1-3 charakterisiert ist. Dieser Zustand ist mit einer Reihe von negativen gesundheitlichen Folgen, einschließlich HIV Erwerb ⁴ zugeordnet, und es kann schwierig sein, klinisch ^{5 zu} verwalten. Darüber hinaus hat Diagnose der BV über die Verwendung der Gramfärbung von vaginalen Abstrich Abstriche, die auf verschiedenen numerischen Kriterien ^6,7 erzielt wird, sind verlassen. Während diese Diagnose ist einfach, kostengünstig und gut geeignet, um mit beschränkten Ressourcen, kann er von Problemen im Zusammenhang mit subjektiven Interpretationen und es gibt nicht ein detailliertes Profil der Zusammensetzung der vaginalen Mikroflora ⁸ leiden. Aktuelle deep sequencing Bemühungen haben eine reiche, vielfältige vaginale Mikroflora mit der geoffenbartendeutliche Unterschiede zwischen den Proben von Personen, die mit BV im Vergleich zu denjenigen Personen, die als normal ^9,10 sind, die bei der Identifizierung einer Reihe von potenziellen Zielen für die molekulare Diagnostik der BV ^11,12 geführt hat diagnostiziert werden übernommen. Diese Studien haben eine Fülle von nützlichen Informationen zur Verfügung gestellt, aber tief-Sequenzierung ist noch nicht praktisch wie ein diagnostisches Verfahren in einer klinischen Umgebung. Wir haben vor kurzem ein Verfahren zur schnellen Profilierung der vaginalen Mikroflora in einem Multiplex-Format Verwendung von Oligonukleotid-gekoppelte fluoreszierende Kügelchen mit Erkennung auf einem Luminex-Plattform ¹³ beschrieben. Diese Methode, wie aktuelle Gramfärbung-basierte Methoden, ist eine schnelle und einfache, aber fügt den zusätzlichen Vorteil der Nutzung molekularer Erkenntnisse aus der Sequenzierung Studien in Sonde Design. Diese Methode bietet daher eine Möglichkeit, die wichtigsten Mikroorganismen, die in einer vaginalen Abstrich, mit dem BV mit hoher Spezifität und Sensitivität comp diagnostizieren können, werden ProfileARED auf Gram-Färbung, während die Bereitstellung zusätzlicher Informationen über die Arten Präsenz und Fülle in einem semi-quantitative und schnelle Weise. Das Multiplex-Verfahren ist erweiterbar und über den Bereich der aktuellen quantitative PCR-Assays für bestimmte Organismen, die derzeit auf 5 oder 6 verschiedene Tests in einer einzigen Probe ¹⁴ ist begrenzt. Wichtig ist, dass das Verfahren nicht auf den Nachweis von Bakterien in Vaginaltupfer begrenzt und kann leicht angepasst werden, um schnell Profil nahezu jede mikrobielle Gemeinschaft von Interesse. Zum Beispiel haben wir vor kurzem damit begonnen, diese Methode auf die Entwicklung von Diagnose-Tools gelten für den Einsatz in Kläranlagen.

Protocol

Diese Methode wurde in der Forschung in Dumonceaux et al verwendet. J. Clin. . Microbiol 47, 4067-4077, doi: 10.1128/jcm.00112-09 (2009).

Eine schematische Darstellung des gesamten Verfahrens ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Bead-Kopplung

Dies beschreibt die Methoden zur Kopplung Oligonukleotid-Sonden für Polystyrol Luminex-Beads (siehe Tabelle 2) verwendet werden. Volumes sind etwas für die Evaluierung neuer Fängersonden probeweise angepasst; diese Bände sind in Klammern angegeben.

1. Nehmen Sie 1-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimid HCl (EDC)-Pulver von -....

Discussion

Die Spezifität des Signals Generation von entscheidender Bedeutung ist, Sie müssen sicher sein, dass das Signal beobachtet reflektiert wirklich den Nachweis von Amplikon aus diesem Organismus erzeugt. Software wie PrimerPlex (Premier Biosoft) kann helfen, Sonden, die effizient hybridisieren Design, aber sie kann oder auch nicht, um Nicht-Zielarten cross-Hybridisierung. Als universelle PCR-Primer verwendet werden, wie in diesem Protokoll beschrieben, ist es wichtig zu bedenken, dass das Amplifikat generiert alle Organism.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligonukleotid-Namen	Firma	Sequenz 1
H279BP	Invitrogen, IDT, oder andere	Biotin-OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC
H280		YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT
H1612BP		Biotin-OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC
H1613		CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT
1O, Phosphorothioat-C, E, Phosphorothioat-G, F, Phosphorothioat-A; I, Inosin, Y, C oder T; R, A oder G, K, T oder G, S, C oder G.

Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
1-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimid HCl (EDC)	Durchstechen	22980
Fluoreszierende Polystyrol-Kügelchen: MICROPLEX Microspheres (Luminex) oder Bio-Plex COOH Perle (Bio-Rad)	Luminex oder Bio-Rad	Bio-Rad: 171-506xxx wobei xxx entspricht der Raupe Kennung	Magnetic Beads sind immer für Oligonukleotid-Kopplung zur Verfügung und kann gewisse Vorteile bieten. Haben Sie nicht von diesen Autoren versucht worden.
Fänger-Oligonukleotide (5 'Amino C12 modifiziert)	Invitrogen, IDT, oder andere	verschiedene	Entsalzt Reinheitsgrad ist akzeptabel. Sequenzen der Fängersonden zur Vaginaltupfer charakterisieren, sind in dem Manuskript, an dem dieses Protokoll 13 basiert zur Verfügung gestellt.
T7Exonuklease	New England Biolabs	M0263S
Streptavidin-R-Phycoerythrin (SA-PE)	Invitrogen	S-866	Achten Sie darauf, hohe Reinheit SA-PE zu erhalten; diesem Katalog-Nummer wird empfohlen
Schutzrohr 96-Well-PCR-Platten	Fischer	CS006509	passen in beiden 96-well Thermocycler und BioPlex Maschine
Schutzrohr Dichtmatte	Fischer	CS006555	Kann wieder verwendet werden; abwaschen mit Seifenwasser, gut spülen und trocknen
5M TMAC	Sigma	T3411
Bio-Plex oder Luminex-Gerät	Bio-Rad oder Luminex	Bio-Rad: 171-000201
PrimerPlex Software für Design der Sonde	Premier Biosoft	www.premierbiosoft.com	Empfohlen für Luminex-Sonde deZeichen, obwohl auch andere Software-Plattformen verwendet werden kann

Komponente	ul / Test	μl/100 Assays	Endkonzentration
10x PCR-Puffer (Invitrogen)	5	500	1x
50 mM MgCl 2 (Invitrogen)	2,5	250	2,5 mM
10 mM dNTP	1	100	0,2 mM jedes
H279BP, 25 uM	0,25	25	375 nm
H1612BP, 25 uM	0,75	75	125 nM
H280, 25 uM	0,25	25	375 nm
H1613,25 uM	0,75	75	125 nM
Wasser	34	3400	---
Totals	44,5	4450