Wir beschreiben ein Multiplex-Verfahren für den Nachweis von Mikroorganismen in einer Probe mit Oligonukleotid-gekoppelte fluoreszierende Kügelchen. Amplicon aus allen Organismen in einer Probe ist es, ein Gremium von Sonde-gekoppelten Beads hybridisiert. Ein Luminex oder Bio-Plex Gerät wird verwendet, um jede Perle für Perle Art und Hybridisierungssignal Abfrage.
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Methodenartikel
Multiplex Nachweis von Bakterien in komplexen Clinical and Environmental Proben mit Oligonukleotid-gekoppelten Fluoreszenz-Mikrosphären
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Bakterielle Vaginose (BV) ist ein immer wiederkehrendes polymikrobiellen Syndrom, das durch einen Wechsel in die "normale" Mikroflora von einer Mikroflora durch eine Reihe von Bakterienarten, darunter Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae dominiert Lactobacillus-dominiert, und andere 1-3 charakterisiert ist. Dieser Zustand ist mit einer Reihe von negativen gesundheitlichen Folgen, einschließlich HIV Erwerb 4 zugeordnet, und es kann schwierig sein, klinisch 5 zu verwalten. Darüber hinaus hat Diagnose der BV über die Verwendung der Gramfärbung von vaginalen Abstrich Abstriche, die auf verschiedenen numerischen Kriterien 6,7 erzielt wird, sind verlassen. Während diese Diagnose ist einfach, kostengünstig und gut geeignet, um mit beschränkten Ressourcen, kann er von Problemen im Zusammenhang mit subjektiven Interpretationen und es gibt nicht ein detailliertes Profil der Zusammensetzung der vaginalen Mikroflora 8 leiden. Aktuelle deep sequencing Bemühungen haben eine reiche, vielfältige vaginale Mikroflora mit der geoffenbartendeutliche Unterschiede zwischen den Proben von Personen, die mit BV im Vergleich zu denjenigen Personen, die als normal 9,10 sind, die bei der Identifizierung einer Reihe von potenziellen Zielen für die molekulare Diagnostik der BV 11,12 geführt hat diagnostiziert werden übernommen. Diese Studien haben eine Fülle von nützlichen Informationen zur Verfügung gestellt, aber tief-Sequenzierung ist noch nicht praktisch wie ein diagnostisches Verfahren in einer klinischen Umgebung. Wir haben vor kurzem ein Verfahren zur schnellen Profilierung der vaginalen Mikroflora in einem Multiplex-Format Verwendung von Oligonukleotid-gekoppelte fluoreszierende Kügelchen mit Erkennung auf einem Luminex-Plattform 13 beschrieben. Diese Methode, wie aktuelle Gramfärbung-basierte Methoden, ist eine schnelle und einfache, aber fügt den zusätzlichen Vorteil der Nutzung molekularer Erkenntnisse aus der Sequenzierung Studien in Sonde Design. Diese Methode bietet daher eine Möglichkeit, die wichtigsten Mikroorganismen, die in einer vaginalen Abstrich, mit dem BV mit hoher Spezifität und Sensitivität comp diagnostizieren können, werden ProfileARED auf Gram-Färbung, während die Bereitstellung zusätzlicher Informationen über die Arten Präsenz und Fülle in einem semi-quantitative und schnelle Weise. Das Multiplex-Verfahren ist erweiterbar und über den Bereich der aktuellen quantitative PCR-Assays für bestimmte Organismen, die derzeit auf 5 oder 6 verschiedene Tests in einer einzigen Probe 14 ist begrenzt. Wichtig ist, dass das Verfahren nicht auf den Nachweis von Bakterien in Vaginaltupfer begrenzt und kann leicht angepasst werden, um schnell Profil nahezu jede mikrobielle Gemeinschaft von Interesse. Zum Beispiel haben wir vor kurzem damit begonnen, diese Methode auf die Entwicklung von Diagnose-Tools gelten für den Einsatz in Kläranlagen.
Protokoll
Diese Methode wurde in der Forschung in Dumonceaux et al verwendet. J. Clin. . Microbiol 47, 4067-4077, doi: 10.1128/jcm.00112-09 (2009).
Eine schematische Darstellung des gesamten Verfahrens ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Bead-Kopplung
Dies beschreibt die Methoden zur Kopplung Oligonukleotid-Sonden für Polystyrol Luminex-Beads (siehe Tabelle 2) verwendet werden. Volumes sind etwas für die Evaluierung neuer Fängersonden probeweise angepasst; diese Bände sind in Klammern angegeben.
- Nehmen Sie 1-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimid HCl (EDC)-Pulver von -20 ° C Exsikkator und warm es auf Raumtemperatur.
- Resuspendieren Mikrokugeln durch sonciation in einem Wasserbad Sonicator für 20 Sekunden, dann Vortexen etwa 20 Sekunden.
- Transfer-400 ul (100 ul) von Mikrosphären in ein Eppendorf-Röhrchen (das entspricht 5x10 6 oder 1,2510 6 Mikrosphären). Luminex empfiehlt die Verwendung von geringer Proteinbindung Mikrozentrifugenröhrchen (zB Eppendorf Protein LoBind Röhrchen, Katalog 0030 108,094), die abgekoppelt Perlen vom Kleben an den Rohren und stören bead Erholung verhindern. Wir haben nicht gefunden, daß dieses Problem mit Standard-Polypropylen Mikrozentrifugenröhrchen, die wir verwenden in der Regel (zB VWR Katalog-Nummer 87003-298) werden.
- Pellet bei 14000 xg für 1 Minute. Entfernen und den Überstand verwerfen.
- Resuspendieren der Mikrosphären in 50 ul (12,5 ul) bei Raumtemperatur 0,1 M 2 - (N-Morpholino) ethansulfonsäure (MES) pH 4,5.
- Bereiten Sie eine frische Lösung von EDC bei 10 mg / ml in Wasser.
- Bereiten Sie weniger als 1 ml dieser Lösung durch Wiegen 5-10 mg EDC im analytischen Maßstab, dann Zugabe von Wasser bis 10 mg / ml.
- Add 1 nmol von 5'-Amino C12-modifizierte Fänger-Oligonukleotid (Tabelle 2) zu Mikrosphären und vortexen. 1 nmol ist 5 ul 200 uM OligoNukleotid.
- Fügen Sie 2,5 ml frisches EDC-Lösung, um die Mikrosphären und vortexen für 5 Sekunden.
- Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten im Dunkeln.
- Entsorgen Sie die EDC-Lösung (Schritt 1,6) und bereiten eine frische Probe von 10 mg / ml EDC in Wasser wie oben beschrieben (Schritt 1.6).
- Fügen Sie weitere 2,5 ml frisches EDC-Lösung, um die Mikrosphären und Vortex für 5 Sekunden.
- Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten im Dunkeln.
- Waschen Sie die Beads durch Zugabe von 1 ml 0,02% Tween 20. Vortex (optional für 20 Sekunden sowie beschallen), um die Perlen zu resuspendieren.
- Centrifuge 14000 xg 1 Minute. Entfernen und den Überstand verwerfen.
- Waschen Sie die Kugeln wieder durch Zugabe von 1 ml 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS). Vortex (optional für 20 Sekunden sowie beschallen), um die Perlen zu resuspendieren.
- Centrifuge 14000 xg 1 Minute. Entfernen und den Überstand verwerfen.
- Resuspendieren der Beads in 100 ul (25 ul) Tris-EDTA (TE)-Puffer [10 mM Tris-Cl pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0].
- Zählen Sie die Perlen in einer Zählkammer oder Coulter-Zähler auf die Lager-Konzentration zu bestimmen.
- Bereiten Sie eine Microsphere Master Mix durch Verdünnen jede Perle, um eine Endkonzentration von 100 Perlen / ul in TE-Puffer. Pool gekoppelt Perlen entsprechend der gewünschten plex des Tests (zB für eine 10-plex-Assay-Mix 10 verschiedene gekoppelt Perlen an einer Endkonzentration von 100/μl der jede Perle).
- Bewahren Sie die Microsphere Master Mix bei 4 ° C im Dunkeln. Die Mischung kann über Monate gelagert werden, wenn unter diesen Bedingungen gehalten.
2. Chaperonin 60 Universal-Ziel (cpn60 UT) Amplikon Produktion und Erzeugung von Einzelsträngen.
- Generieren Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Produkt für jede Probe. Fügen Sie die Phosphorothioat-und Biotin-modifizierten 5 'Primer (Tabelle 1). Siehe Tabelle 3 für Volumina zu mischen und Konzentrationen.
- Unmittelbar nach der PCR abgeschlossen ist, fügen Sie 2 ul (20 Einheiten) von T7 abonuclease jedem PCR-Röhrchen (die PCR-Puffer wird für die T7 Reaktion genügt). Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur (~ 22-25 ° C) für 40 Minuten.
- Am Ende dieser Inkubation add 12,5 ul 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), pH 8,0 und mischen. Dies ergibt eine Gesamtsumme von ~ 64.5μl einzelner PCR-Produkt.
3. Die Hybridisierung der einzelsträngigen PCR-Produkt auf Oligonukleotid-coupled Polystyrol-Kügelchen.
- Vorwärmen das Gerät bis 60 ° C bis Hybridisierungstemperatur während der Analyse zu erhalten. Biegen Sie auf der Plattform Heizer mit dem Instrument der Software und achten Sie darauf, die Messing-Heizblock, dass die PCR-Stil Platte, die die hybridisierten bead Mischung enthält passt zu verwenden.
- Resuspendieren Microsphere Master Mix (Schritt 1,20) mit einer Pipette, verzichten entsprechende Menge in ein Eppendorf-Röhrchen, Kappe der Röhre, und beschallen in einem Wasserbad Sonicator für 2 Minuten. Alternativ zu gewährleisten absolute Konsistenz in bead resuspension, kann das Mikrokügelchen Master-Mix durch Vortexen und Pipettieren, dann Ultraschallbehandlung wie oben resuspendiert werden, dann Dosieren der gewünschten Menge in ein Eppendorf-Röhrchen aus Polypropylen.
- Dispense 17 ul der einzelnen PCR-Produkt (Schritt 2,2) in die entsprechenden Vertiefungen einer Low-Profile-96-well PCR-Platte Schutzrohr (Tabelle 2). Add 33 ul resuspendiert, sonciated bead Mischung in jede Vertiefung. Deckel mit Silikon-Deckel (Tabelle 2) und tippen Sie vorsichtig.
- Legen Sie die Platte in den Thermocycler mit einem Programm von: 95 ° C für 5 min, 60 ° C für 10 min, 60 ° C zu halten, 60 ° C für 5 min, zu beenden. Starten Sie das Programm.
- Machen Sie frische Streptavidin-Phycoerythrin (SA-PE)-Lösung, Sie werden 25 ul pro Well müssen (make mehrere Brunnen extra). Machen Sie SA-PE-Lösung durch Verdünnung Lager SA-PE (1 mg / ml) 1:50 bis 20 pg / ml mit 1x Tetramethylammoniumchlorid (TMAC) Puffer (3 M TMAC, 0,1% Sarkosyl; 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 ; 4 mM EDTA, pH 8,0).
- Wenn der Thermocycler die 60 ° C zu halten Schritt erhält,öffnen Sie den Deckel, entfernen Sie die Schutzhülle aus Silikon und fügen SA-PE-Lösung direkt in jede Vertiefung (nehmen Sie nicht die Platte aus dem Thermocycler). Ersetzen Sie die Silikonhülle, schließen Sie den Thermocycler Deckel und der Wiederaufnahme des Programms.
- Wenn das Programm abgeschlossen ist, nehmen Sie die Platte aus und schnell zu übertragen, um die BioPlex Maschine zu lesen. Platte muss innerhalb von 10 Minuten abgelesen werden. Lesen Sie bei 60 ° C; sicherzustellen, dass die BioPlex zu dieser Temperatur wurde vorgewärmt. Seien Sie sicher, dass die Sonde Höhe eingestellt ist, die Platte verwendet, wie in der Bedienungsanleitung für das Gerät verwendet werden, beschrieben unterzubringen.
- Für eine genaue Wulst und Signalerfassung, muss die Gate-Einstellungen auf dem BioPlex nach der Art der Mikrosphären verwendet eingestellt werden. BioRad Polystyrol-Kügelchen erfordern ein Tor Einstellung 4,335-10,000 während magnetische Mikrosphären eine Einstellung von 5.000-25.000 erfordern. Es besteht auch die Möglichkeit, den Teller mit dem High PMT-Einstellung, die der Reporter Gain-Wert erhöht. Dies kann increase die Intensität der unteren Signale jedoch ist es wichtig, auch eine negative Kontrolle als Hintergrund-Signal auch erhöht werden.
4. Repräsentative Ergebnisse:
Eines unserer Ziele bei der Entwicklung und Umsetzung dieses Tests war es so einfach und einheitlich wie möglich zu machen. Deshalb optimiert den kritischen Nachverstärkung Schritte, einschließlich T7 Exonuklease-Behandlung Zeit und Hybridisierung Zeit, um einen Test, der in einer angemessenen Frist abgeschlossen werden kann entwickeln. Wie in Abbildung 2A gezeigt, ist T7 Behandlung des Amplikons wichtig für die Signalerzeugung, da die meisten Sonden wenig oder gar kein Signal mit kurzen oder gar keinen T7 Behandlung hatte. Das Signal stieg linear bis ca. 40 Minuten, zu welchem Zeitpunkt das Signal zu erhöhen verlangsamt. Keine Verschlechterung des Signals war auch bei 2 Stunden T7 Behandlung beobachtet, was darauf hinweist, dass die Phosphorothioat Modifikation der Primer sehr wirksam bei der Verhinderung targe istt-Strang Abbau, wie beschrieben 15. Wir haben 40 Minuten für T7 Behandlung Zeit, um die Gesamt-Protokoll zu minimieren, aber es ist klar, 2A, dass T7 Behandlung kann sich über viel länger. Wir haben auch den Effekt der Hybridisierung Zeit auf Signalerzeugung (Abbildung 2B) bestimmt und festgestellt, dass 10 Minuten reichen für maximale Signal war, war da kein weiterer Anstieg der Signal auch nach 4 Stunden der Hybridisierung beobachtet. Daher wurde eine 10 Minuten Hybridisierung gewählt, erneut, um den gesamten Test zu minimieren. Mit diesen Ergebnissen im Hinterkopf, und mit schnellen DNA-Extraktion Techniken wie InstaGene (Bio-Rad), kann der gesamte Test einschließlich DNA-Extraktion, PCR, und Luminex-Analyse in 4-5 Stunden abgeschlossen sein.
Auf einem Warnhinweis, kann der Grad der Aggregation der Polystyrol-Kügelchen in einem Luminex oder BioPlex ausgeführt haben einen großen Einfluss auf die Effizienz des Assays. Die BioPlex Software zeigt das Niveau der Bead-Aggregation, die der auftritt, wennmehr als eine Perle ist in der Laser-Pfad und führt zum Ausschluss des Hybridisierungssignal aus dem Aggregat erkannt. Scheinbare Bead-Aggregation kann auch durch jede Feinstaub, der nicht die richtige Größe für eine einzelne Perle verursacht werden, und kann sogar durch Luftblasen verursacht werden. In jedem dieser Ereignisse wird das Signal von der Perle Aggregat, Luftblase, oder Partikel verworfen. In den meisten Fällen finden wir, dass Bead-Aggregation ist minimal (Abbildung 3A) und dem angestrebten Niveau von 100 Zählen von Ereignissen für jede Perle ist leicht erreichbar. Gelegentlich zeigen jedoch, die Perlen einer moderaten (Abbildung 3B) oder schwerer (Abbildung 3C) Aggregationsebene. In diesen Fällen, da die meisten Daten verworfen wird, kann das Gerät Probleme haben, erreichen 100 Veranstaltungen pro Bead Art und die Ergebnisse fraglich sein kann. Die Beschallung (Schritt 3.2) soll Bead-Aggregation zu minimieren. Darüber hinaus können die Speicherung der Kügelchen als eine verdünnte Mikrosphäre Master-Mix (Schritt 1.20) zu helfen. Wir haben, dass der Ausschluss TMAC aus dem Hy bemerktdization Puffer - Zugabe zu den SA-PE Verdünnungsmittel statt (Schritt 3,5) - hilft bei der Bead-Aggregation zu minimieren. Darüber hinaus, während wir noch nicht getestet, sind die neueren magnetischen Beads sind aus Luminex oder BioRad gedacht, eine geringere Tendenz zur Aggregation anzuzeigen.
Die Ergebnisse der Anwendung eines 5-plex Luminex Array Targeting G. vaginalis, A. vaginae, L. iner, L. crispatus und L. gasseri zusammen mit den entsprechenden Gram gefärbt vaginalen Abstrich Abstriche sind in Abbildung 4 dargestellt. Diese Proben wurden aus einer einzigen Person zu mehreren Zeitpunkten entnommen. Zum Zeitpunkt 0 wurde die Person mit BV basierend auf Gram-Färbung diagnostiziert (Abbildung 4A) und der Luminex Ergebnisse aus dieser gleichen Probe (Abbildung 4B) zeigen, dass der Organismen in dem Array, G. vertreten vaginalis wurde am häufigsten, während A. vaginae und L. iner waren ebenfalls positiv. Neun Tage später war das Individuum noch BV positiv und die signal für G. vaginalis habe deutlich zugenommen, während A. vaginae und L. iner noch positiv. Wichtig ist, dass nach dieser Zeit die einzelnen begann Übergang zu einer normalen Mikroflora als Gram-positive Bazillen wurden in den Abstrichen nachweisbar (Abbildung 4A), während das Signal für G. vaginalis nachgelassen und das Signal für L. iner erhöht (Abbildung 4B). Durch unsere ursprüngliche Definition von BV mit dieser Methode (Proben positiv für G. vaginalis und / oder A. vaginae wurden als positive BV) 13, wurde dieser individuellen BV positive zu allen Zeitpunkten, obwohl die Gram-Färbung nicht zu erkennen G. vaginalis in den letzten beiden Zeitpunkten. Mit dem Luminex hier beschriebenen Verfahren können Trends schnell zu Sequenzierung-basierte Methoden verglichen werden, und die Ergebnisse der Luminex-Assay in der Regel bestätigen Gramfärbung 13, während die Bereitstellung zusätzlicher Informationen auf den Organismus Identität und Fülle.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Luminex-Protokoll für die Bestimmung der Mikroflora Profil eines komplexen klinischen oder Umwelt-Probe. Das Protokoll beginnt mit Template-DNA, die aus der Probe von Interesse extrahiert wurde. (1) generieren PCR-Produkt von Template-DNA-Strang mit spezifischen biotinylierten, Phosphorothioat-modifizierte cpn60 UT PCR-Primer mit unmodifizierten cpn60 UT PCR-Primer (Tabelle 1) gekoppelt ist; (2) Dies erzeugt eine PCR-Produkt-Pool, die die Mikroflora mit dem Biotin- Phosphorothioat Modifikation auf einem Strang, (3) Digest die doppelsträngige PCR-Produkt mit T7 Exonuklease, die nicht abbauen können die Phosphorothioat-modifizierten Strang und erzeugt somit Einzelstrang-DNA, die am 5'-Ende mit Biotin modifiziert wird, (4) Paar Polystyrol-Kügelchen auf artspezifische cpn60 UT-Sonden - jede Perle hat einen einzigartigen spektralen Adresse (angezeigt durch bead Farbe), die is erkennbar durch die Luminex oder Bio-Plex Gerät, (5) hybridisieren die einzelnen PCR-Produkt erzeugt aus der Probe von Interesse, die Sammlung von artspezifischen Oligonukleotid-gekoppelten Kügelchen, (6) Add Streptavidin-Phycoerythrin-Konjugat, das bindet das biotinylierte Einzelstrang-PCR-Produkt und dient als Indikator für die Hybridisierung; (7) Bestimmen Sie die spektrale Adresse (bead Identität) und Hybridisierung Signalintensität mit einem Luminex oder Bio-Plex Gerät. Mindestens 100 Perlen sind für jede Perle Identität gezählt und die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der Phycoerythrin-Signal als Ausgang berichtet. Bis zu 100 verschiedene Bead-Typen können gleichzeitig ausgewertet werden, sondern ein Test, welche die Diskriminierung von drei Kügelchen Typen dargestellt. (8) Wenn die MFI PCR aus der gleichen Probe repliziert erzeugt wird, deutlich größer als die negative Kontrolle für eine bestimmte Perle (one-tailed Student t-Test, p <0,05), wird die Probe als für den Organismus positiv.
Abbildung 2. Optimierung der Luminex-Assay-Parameter. Fünf verschiedene Sonden gezielt zu Peptostreptococcus anaerobius wurden mit Amplikons aus einer gemischten Vorlage generiert verwendet mit Plasmiden, die die geklonten cpn60 UT von 20 Bakterien bekannt, mit der Vagina in Verbindung gebracht werden, einschließlich P. anaerobius. (A). Wirkung von T7 Exonuklease-Behandlung Zeit. Die oben beschriebenen Protokoll folgte aber die Zeit der Behandlung mit T7 Exonuklease wurde vor der Hybridisierung und das mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) wurde für alle Sonden bestimmt abwechslungsreich. (B). Einfluss der Hybridisierung Zeit. Die oben beschriebenen Protokoll wurde mit einer Vielzahl von Hybridisierung Zeiten folgten. Das gleiche Sätze von Sonden wurden mit einem Amplikon aus derselben Vorlage erzeugt, wie in A und die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für alle Sonden ermittelt wurde.
Abbildung 3. Bestimmung der Bead-Aggregation mit BioPlex Software. Drei Beispiele sind BioPlex läuft in dem das Niveau der Raupe Aggregation (A) zulässig (5%) gegeben; (B) Borderline (50%), und (C) nicht akzeptabel (80%).
Abbildung 4. Die Anwendung eines 5-plex Luminex Array BV Diagnose in sequentiellen Proben von der gleichen Person übernommen. (A). Gram-gefärbten Objektträger, welche die traditionellen Diagnose verwendet werden, um jede Probe für BV zu beurteilen. (B). Die Anwendung eines 5-plex Luminex Array vorbereitet und durchgeführt, wie in diesem Protokoll, um die gleichen vier Proben in (A) gezeigt, beschrieben. Bakterielle Ziele, deren MFI-Signal war deutlich positiv von unserer Definition (one-tailed Student t-Test, p <0,05) sind mit einem Sternchen (*) gekennzeichnet.
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Diskussion
Die Spezifität des Signals Generation von entscheidender Bedeutung ist, Sie müssen sicher sein, dass das Signal beobachtet reflektiert wirklich den Nachweis von Amplikon aus diesem Organismus erzeugt. Software wie PrimerPlex (Premier Biosoft) kann helfen, Sonden, die effizient hybridisieren Design, aber sie kann oder auch nicht, um Nicht-Zielarten cross-Hybridisierung. Als universelle PCR-Primer verwendet werden, wie in diesem Protokoll beschrieben, ist es wichtig zu bedenken, dass das Amplifikat generiert alle Organism...
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Wir danken Alberto Severini und Vanessa Goleski um Hilfe bei der Assay-Entwicklung und kritische Kommentare zu diesem Manuskript. Diese Arbeit wurde von der Public Health Agency of Kanada und der Industrial Research Assistance Program (National Research Council in Kanada) finanziert. Zusätzliche Unterstützung wurde von der University of Saskatchewan Publication Fund erhalten.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Oligonukleotid-Namen | Firma | Sequenz 1 | |
| H279BP | Invitrogen, IDT, oder andere | Biotin-OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC | |
| H280 | YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT | ||
| H1612BP | Biotin-OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC | ||
| H1613 | CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT | ||
| 1O, Phosphorothioat-C, E, Phosphorothioat-G, F, Phosphorothioat-A; I, Inosin, Y, C oder T; R, A oder G, K, T oder G, S, C oder G. |
Tabelle 1. Sequenzen der Oligonucleotide für den universellen cpn60 PCR.
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimid HCl (EDC) | Durchstechen | 22980 | |
| Fluoreszierende Polystyrol-Kügelchen: MICROPLEX Microspheres (Luminex) oder Bio-Plex COOH Perle (Bio-Rad) | Luminex oder Bio-Rad | Bio-Rad: 171-506xxx wobei xxx entspricht der Raupe Kennung | Magnetic Beads sind immer für Oligonukleotid-Kopplung zur Verfügung und kann gewisse Vorteile bieten. Haben Sie nicht von diesen Autoren versucht worden. |
| Fänger-Oligonukleotide (5 'Amino C12 modifiziert) | Invitrogen, IDT, oder andere | verschiedene | Entsalzt Reinheitsgrad ist akzeptabel. Sequenzen der Fängersonden zur Vaginaltupfer charakterisieren, sind in dem Manuskript, an dem dieses Protokoll 13 basiert zur Verfügung gestellt. |
| T7Exonuklease | New England Biolabs | M0263S | |
| Streptavidin-R-Phycoerythrin (SA-PE) | Invitrogen | S-866 | Achten Sie darauf, hohe Reinheit SA-PE zu erhalten; diesem Katalog-Nummer wird empfohlen |
| Schutzrohr 96-Well-PCR-Platten | Fischer | CS006509 | passen in beiden 96-well Thermocycler und BioPlex Maschine |
| Schutzrohr Dichtmatte | Fischer | CS006555 | Kann wieder verwendet werden; abwaschen mit Seifenwasser, gut spülen und trocknen |
| 5M TMAC | Sigma | T3411 | |
| Bio-Plex oder Luminex-Gerät | Bio-Rad oder Luminex | Bio-Rad: 171-000201 | |
| PrimerPlex Software für Design der Sonde | Premier Biosoft | www.premierbiosoft.com | Empfohlen für Luminex-Sonde deZeichen, obwohl auch andere Software-Plattformen verwendet werden kann |
Tabelle 2. Reagenzien und Geräten.
| Komponente | ul / Test | μl/100 Assays | Endkonzentration |
|---|---|---|---|
| 10x PCR-Puffer (Invitrogen) | 5 | 500 | 1x |
| 50 mM MgCl 2 (Invitrogen) | 2,5 | 250 | 2,5 mM |
| 10 mM dNTP | 1 | 100 | 0,2 mM jedes |
| H279BP, 25 uM | 0,25 | 25 | 375 nm |
| H1612BP, 25 uM | 0,75 | 75 | 125 nM |
| H280, 25 uM | 0,25 | 25 | 375 nm |
| H1613,25 uM | 0,75 | 75 | 125 nM |
| Wasser | 34 | 3400 | --- |
| Totals | 44,5 | 4450 |
Tabelle 3. Empfohlene Mischungen für die PCR mit modifizierten cpn60 UT Primer (Tabelle 1). Der Test ist bis zum 5 ul der Template-DNA und 0,5 ul (2,5 U) Taq DNA Polymerase (Invitrogen) gesetzt. Normalerweise großen Mengen hergestellt werden (z. B. ausreichend für 100 Tests) und bei -20 ° C.
Referenzen
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