Visualisierung von Caenorhabditis elegans Cuticle Strukturen mit der lipophilen Vital Dye, DiI

Summary

Wir präsentieren eine Methode zur Nagelhaut in Live-Visualisierung C. elegans Mit dem rot fluoreszierenden Farbstoff lipophil DiI (1,1 '-Dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine Perchlorat), die häufig in Verwendung C. elegans Zu visualisieren umwelt ausgesetzt Neuronen. Mit diesem optimierten Protokoll werden Alen und ringförmige Strukturen Kutikula von DiI gefärbt und mit der Verbindung der Mikroskopie.

Abstract

Die Kutikula von C. elegans ist eine sehr widerstandsfähige Struktur, die das Äußere des Tieres ^1-4 umgibt. Die Nagelhaut schützt nicht nur das Tier aus der Umwelt, sondern bestimmt auch Körperform und spielt eine Rolle in Motilität ^4-6. Mehrere Schichten von epidermalen Zellen abgesondert umfassen die Kutikula, darunter eine äußerste Lipid-Schicht ^7.

Umlaufende Stege in der Kutikula genannt Kreisringe Muster der Länge des Tieres und sind in allen Phasen der Entwicklung ⁸ vorhanden. Alae sind Längsrippen, die vorhanden sind während bestimmter Phasen der Entwicklung, darunter L1, Dauer, und adulte Stadien ^2,9. Mutationen in Genen, die Kutikula Kollagen Organisation beeinflussen können alter Kutikula Struktur und tierischen Körper Morphologie ^5,6,10,11. Während Kutikula Bildgebung mit Verbindung Mikroskopie mit DIC-Optik ist es möglich, aktuelle Methoden, die Highlight Kutikula Strukturen gehören FluoreszenzProzent Transgenexpression ^12, Antikörper-Färbung ¹³ und Elektronenmikroskopie ^1. Labeled Weizenkeimagglutinin (WGA) wurde ebenfalls verwendet, um Kutikula Glykoproteine ​​visualisieren, ist aber bei der Lösung von feineren Strukturen Kutikula ¹⁴ begrenzt. Die Färbung der Kutikula Oberfläche unter Verwendung von fluoreszierenden Farbstoff wurde beobachtet, aber nie im Detail ¹⁵ gekennzeichnet. Wir präsentieren eine Methode zur Nagelhaut in Live-C visualisieren elegans mit dem rot fluoreszierenden Farbstoff lipophil DiI (1,1 '-Dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine Perchlorat), die üblicherweise in C verwendet elegans zu visualisieren umwelt ausgesetzt Neuronen. Diese optimierte Protokoll für DiI Färbung ist eine einfache, robuste Methode für hochauflösende Fluoreszenz-Visualisierung von Ringen, alae, Vulva, männlichen Schwanz, und Hermaphroditen Tailspike in C. elegans.

Protocol

1. Vorbereitung der DiI Fleck

1. Bereiten Sie eine Stammlösung von 20 mg / mL DiI (Biotium, Inc., Hayward, CA) in DMF. DiI ist lichtempfindlich, so schützen DiI von Licht durch das Einwickeln in Folie.
2. Erstellen Sie ein Arbeitsverzeichnis Verdünnung von DiI durch Zugabe von 0,6 ul DiI Lager auf 399,4 ul M9 für jede Population. Dies sollte eine abschließende Arbeiten Verdünnung von 30 ug / mL DiI in M9. Dies kann bis zur Färbung mehrere Populationen gleichzeitig skaliert werden. Schild DiI von Licht durch Umwickeln des Rohres (s) in Folie.

2. Vorbereitung der Nematoden

1. Verwenden Sie eine 60 mm Platte mit ....

Discussion

Die DiI Färbung hier vorgestellte Methode ermöglicht eine relativ schnelle und bequeme Möglichkeit, um die Schuppenschicht in C. elegans zu visualisieren. Durch Wiederverwendung und Optimierung eines Verfahrens gemeinhin Bild umwelt ausgesetzt sensorischen Neuronen ^15,17 verwendet wird, kann DiI verwendet werden, um Fluoreszenz-Färbung sowohl Alen und ringförmige Strukturen (Abbildungen 1 und 2) sowie der Vulva, männlichen Schwanz, und Hermaphroditen Tailspike werden (Abbildung 3). Wir haben festgest.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagenzien	Synonyme	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
DiI	1,1 '-Dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine Perchlorat	Biotium, Inc.	60010	Lager Verdünnung: 20 mg / mL in DMF Gebrauchsverdünnung: 30 mg / mL
DMF	Dimethylformamid	Sigma-Aldrich, Inc.	D4551
Triton X-100	Octylphenoxypolyethoxyethanol	VWR International, LLC.	EM-9410
M9	22mm KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, 86mm NaCl, 1 mM MgSO 4
NGM	Nematode Wachstumsmedium	IPM Scientific, Inc.	11006-501	Kann folgenden NGM-Agar-Protokoll 18 hergestellt werden
Agar-Agar		EMD Chemicals, Inc.	1,01614	4% in Wasser
Levamisol	Levamisol hydrochloride	Sigma-Aldrich, Inc.	31742	100 pM - 1 mM Levamisol nach Bedarf
Objektträger		VWR International, LLC.	16005-106
Deckgläser		VWR International, LLC.	16004-302
Compound Rahmen		Carl Zeiss, Inc.	A1m	Verwenden Sie Ziele auf die Bedürfnisse des Experiments überein
TRITC oder anderen kompatiblen Filter		Chroma Technology Corp	49005	ET - DsRed (TRITC/Cy3) gesputterten Filter gesetzt