Summary
Bicelles sono miscele di lipidi / amphiphile che mantengono proteine di membrana (MP) all'interno di un doppio strato lipidico, ma hanno un comportamento unico che facilita la fase di high-throughput screening da robot cristallizzazione. Questa tecnica ha prodotto con successo un certo numero di strutture ad alta risoluzione da entrambe le fonti procariote ed eucariote. Questo video descrive i protocolli per la generazione della miscela lipidica bicelle, incorporando i deputati nella miscela bicelle, la creazione di prove cristallizzazioni (manualmente così come robot) e cristalli raccolta dal mezzo.
Abstract
Proteine di membrana (MP) giocano un ruolo critico in molti processi fisiologici come il pompaggio di molecole specifiche attraverso il doppio strato di membrana impermeabile in caso contrario che circonda tutte le cellule e gli organelli. Alterazioni nella funzione del risultato parlamentari in molte malattie ei disturbi umani, quindi, una conoscenza intricata delle loro strutture rimane un obiettivo critico per la ricerca biologica. Tuttavia, la determinazione della struttura dei deputati rimane una sfida significativa spesso derivanti dalla loro idrofobicità.
Parlamentari hanno notevoli regioni idrofobiche incorporato all'interno del doppio strato. I detergenti sono spesso usati per solubilizzare queste proteine dal doppio strato generando una proteina-detergente micellare che possono poi essere manipolati in modo simile come proteine solubili. Tradizionalmente, i processi di cristallizzazione procedere con una proteina-detergente miscela, ma spesso resistono cristallizzazione o produrre cristalli di scarsa qualità. Questi problemi sorgono a causa dellaincapacità del detersivo per simulare adeguatamente il doppio strato con conseguente scarsa stabilità ed eterogeneità. Inoltre, gli scudi detergente sulla superficie idrofobica del MP riducendo la superficie disponibile per i contatti cristallo. Per aggirare questi inconvenienti i parlamentari possono essere cristallizzate nei media lipidico, che più da vicino simula l'ambiente endogeno, ed è recentemente diventata una tecnica de novo per la cristallizzazione MP.
Lipidico fase cubi (LCP) è un tridimensionale doppio strato lipidico penetrata da un sistema interconnesso di canali acquosi 1. Anche se monoolein è la scelta di lipidi, lipidi correlati come monopalmitolein e monovaccenin sono stati utilizzati anche per fare LCP 2. Parlamentari sono incorporati nella LCP dove si diffondono in tre dimensioni e cristallo nuclei feed. Un grande vantaggio del LCP è che la proteina rimane in un ambiente più nativo, ma il metodo ha una serie di inconvenienti tecnici compresi visc altaosity (che richiedono apparati specializzati) e le difficoltà nella visualizzazione di cristallo e la manipolazione 3,4. A causa di queste difficoltà tecniche, abbiamo utilizzato un altro mezzo lipidico per la cristallizzazione-bicelles 5,6 (Figura 1). Bicelles sono miscele di lipidi / amphiphile costituito dal taglio di un lipide fosfatidilcolina (DMPC) con un amphiphile (CHAPSO) o una catena corta lipidi (DHPC). All'interno di ogni disco bicelle, le molecole generano un doppio strato lipidico mentre la linea amphiphile molecole apolari che fornisce i bordi proprietà benefiche di entrambi doppi strati e detergenti. È importante sottolineare che, sotto la loro temperatura di transizione, proteine bicelle miscele hanno una viscosità ridotta e sono manipolati in modo simile come detergente-solubilizzato parlamentari, rendendo bicelles compatibile con i robot cristallizzazione.
Bicelles sono stati utilizzati con successo per cristallizzare proteine di membrana diverse 5,7-11 (Tabella 1). Questa raccolta in crescitadelle proteine dimostra la versatilità di bicelles per cristallizzare sia elicoidale alfa e beta parlamentari foglio da fonti procariote ed eucariote. A causa di questi successi e la semplicità di high-throughput attuazione, bicelles dovrebbero far parte dell'arsenale di ogni cristallografo proteina di membrana è. In questo video, si descrive la metodologia bicelle e fornire uno step-by-step del protocollo per la configurazione high-throughput prove di cristallizzazione purificata parlamentari utilizzando la robotica standard.
Protocol
Cristallizzazione Bicelle base è costituito da quattro fasi fondamentali (Figura 2): i) la preparazione di un lipide bicelle formazione: amphiphile miscela; ii) l'incorporazione di proteine purificate nel mezzo bicelle, iii) prove di cristallizzazione (manualmente o tramite macchina) e iv) visualizzazione, l'estrazione di cristallo e gelo. Questi passaggi sono descritti in dettaglio di seguito
1. Preparazione del Bicelles
Bicelles possono formare in una varietà di lipidi: combinazioni amphiphile e su una vasta gamma di concentrazioni. Pertanto, una composizione a base iniziale su precedenti condizioni di successo-è raccomandato (Tabella 1). La miscela di maggior successo è il DMPC: CHAPSO formulazione bicelle, che può essere acquistato sul mercato come un premiscelato pronto all'uso-formulazione (vedi Tabella dei reagenti sotto) o preparati in laboratorio come descritto. Per questo esercizio ci prepareremo 1 ml di 35% DMPC: CHAPSO miscela con un rapporto 2.8:1 molare.
- La percentuale bicelle può variare tra il 10% -40% con un DMPC: CHAPSO rapporto molare che vanno da 2.6-3.0:1 (Tabella 1).
- Nota: Più alta è la concentrazione bicelle più difficile è quella di sciogliere i lipidi con conseguente maggiore viscosità soluzione. Tuttavia, una formulazione concentrata bicelle può essere vantaggioso quando la concentrazione di proteine è bassa.
- Dissoluzione dei lipidi per ottenere una soluzione omogenea richiede uno sforzo considerevole, rendendo questo passo il più tempo nel metodo bicelle. Passa attraverso tutti i passaggi seguenti fino a quando il DMPC è completamente mista:
- Caldo la miscela a ~ 40 ° C con un bagno di acqua o di un incubatore e vortex per circa 1 minuto.
- Nota: Come nel più cicli vengono effettuati, il riscaldamento il composto si tradurrà in un gel-like constiche, rendendo difficile vortice.
- Raffreddare il composto su ghiaccio e vortex per pochi minuti. Raffreddamento aiuta liquefare la soluzione rendendo più facile vortice.
- Nota: Come nel più cicli vengono eseguiti, la miscela può diventare nuvoloso sul raffreddamento.
- Ripetere i passaggi sopra elencati (1.2.1 e 1.2.2) fino a quando la lipidico è completamente sciolto.
- Nota: Questo processo può richiedere diverse ore. Formazione Bicelle è indicato dai cambiamenti nel comportamento fase del DMPC: formulazione CHAPSO. Al termine, la miscela sarà un gel trasparente pari o superiori a temperatura ambiente e un liquido viscoso sul ghiaccio.
- Caldo la miscela a ~ 40 ° C con un bagno di acqua o di un incubatore e vortex per circa 1 minuto.
- La miscela bicelle è ora pronto all'uso e può essere conservato a -20 ° C per la conservazione a lungo termine (fino a 5 anni). A causa del rischio di idrolisi del gruppo di testa dei fosfolipidi, non è consigliabile archiviare bicelles a temperatura ambiente per lunghi periodi.
2. Incorporazione di proteine in bicelles
La maggior parte delle strutture MP ottenuto dalla bicelles erano cristallizzati in DMPC: CHAPSO concentrazione bicelle vanno da 2 a 8% con una concentrazione di proteine da 8 a 12 mg / ml (Tabella 1). Se possibile, schermate iniziali dovrebbero usare queste linee guida e le concentrazioni aggiuntivi possono essere proiettati in fase di ottimizzazione. Rispetto al metodo LCP, incorporazione di proteine con bicelles è un processo semplice (Figura 3), che dovrebbe essere fatto lo stesso giorno le prove di cristallizzazione.
- Scongelare il DMPC: CHAPSO miscela bicelle a temperatura ambiente fino a quando i cambiamenti di fase di un gel trasparente.
- Nota: Più di gelo-disgelo non influenzerà il comportamento bicelle.
- Mettere il composto sul ghiaccio per liquefare e brevemente vortice di ristabilire una fase omogenea bicelle. Quando posti su ghiaccio la miscela può diventare torbida.
- From questo momento in poi, mantenere la miscela bicelle e proteine purificate su ghiaccio. Ciò manterrà il bicelle in una fase liquida che lo rende suscettibile di pipettaggio.
- Aggiungere il composto alla bicelle purificato detergente-solubilizzate proteine in un (V / V) rapporto 1:4.
- Ad esempio: 100 l di proteine bicelle miscela si ottiene mescolando 80 microlitri di proteine con 20 microlitri bicelle. Se la concentrazione di proteine è di 15 mg / ml e la concentrazione bicelle è del 35%, questo darà un bicelle-incorporato miscela proteica con una concentrazione proteica di 12 mg / ml e una concentrazione bicelle del 7%.
- Mescolare pipettando gentilmente il contenuto su e giù fino a quando la soluzione diventa chiara e omogenea.
- Nota: Se compaiono delle bollicine, un giro veloce (30-60 secondi, 13000 rpm, 4 ° C) con una centrifuga da tavolo può aiutare a rimuoverle.
- Incubare la miscela in ghiaccio per almeno 30 minuti per promuovere incorporazione di proteina into bicelles. La proteina-bicelle impasto è ora pronto per le prove di cristallizzazione.
3. La creazione di processi di cristallizzazione
Altre tecniche di cristallizzazione dei lipidi come il LCP richiede attrezzature specializzate a causa di elevata viscosità del medium, ma il comportamento di fase unica di bicelles permette di implementazione in qualsiasi formato standard, tra cui la cristallizzazione robotica (Figura 3). Processi di cristallizzazione può essere effettuato in uno impiccagione o seduti formati goccia utilizzando le normali schermi disponibili in commercio.
- Se la creazione di vassoi manualmente o utilizzando un robot cristallizzazione, mantenere la proteina-bicelle miscela sul ghiaccio. Ciò manterrà la proteina-bicelle freddo miscela e garantire che la viscosità della soluzione è minimo.
- Prove cristallizzazione manuale - Con un contagocce standard, la proteina-bicelle miscela può essere miscelato con una soluzione serbatoio nello stesso modo come normalmente eseguirea cura di proteine di membrana solubile o detergente-solubilizzato.
- Nota: Conservare la proteina-bicelle miscela in ghiaccio durante le prove.
- Prove cristallizzazione robotica - Abbiamo adattato questi studi per il robot cristallizzazione Mosquito, ma in linea di principio (seguendo le stesse precauzioni), la tecnica dovrebbe essere compatibile con tutti i robot cristallizzazione. I seguenti suggerimenti in modo che la proteina-bicelle miscela rimane fresco e con precisione pipettati dal robot:
- Preraffreddare la piastra ad accumulo di proteine bicelle miscela ponendolo sul ghiaccio.
- Pipetta la proteina-bicelle composto nella piastra e continuare a tenere la piastra su ghiaccio. Questo piatto deve essere l'ultimo elemento ad andare sul robot prima di iniziare la corsa.
- Set-up del vassoio serbatoio e coperchi cristallizzazione su piattaforma 3 e 5, rispettivamente, del robot zanzara.
- Posizionare la piastra contenente proteine bicelle composto su piattaforma 4del robot zanzara. Questo assicura la proteina-bicelle miscela è l'ultimo ad essere preso dal robot ed è immediatamente rilasciato.
- Per evitare che il riscaldamento e la viscosità aumentata, non mescolare il serbatoio con la proteina-bicelle miscela.
- Durante l'esecuzione di schermi multipli, restituire immediatamente la bicelle-proteina piastra di ghiaccio per il raffreddamento non appena una corsa è stata completata.
- Volume delle gocce e il rapporto (proteine: serbatoio) può essere scelta come per le prove di cristallizzazione convenzionali. Per esempio, prove di cristallo iniziale utilizzando il robot Mosquito può essere impostato utilizzando 0,25 microlitri di proteine: miscela bicelle serbatoio maggiorato dello 0,25 microlitri.
- Incubare le prove di cristallo in una camera a 20 ° C. La temperatura è uno screening buono e l'ottimizzazione dei parametri perché il comportamento fase di bicelles dipende dalla temperatura.
- Temperature più elevate indurre la fase lamellare 12 (Figura 1), che ha il vantaggio di pre-organizzazionela proteina in strati. Temperature sotto i 20 ° C possono essere sottoposti a screening, ma non si dovrebbe andare sotto i 4 ° C dal momento che questo può causare i lipidi di precipitare per lunghi periodi di tempo.
- Allo stesso modo, come prove di cristallizzazione tradizionali, prove bicelle devono essere monitorati regolarmente per l'aspetto cristallino e la crescita. Si consiglia di verificare vassoi il 1 ° e 3 ° giorno post-installazione seguita da ispezione settimanale.
- Ottimizzazione di cristallo può essere effettuata con metodi abitualmente utilizzati per i cristalli di detergenti a base di griglia incluso screening, lo screening additivo, cambiando ecc temperature Inoltre, la percentuale bicelle e proteine: il rapporto bicelle può essere variata. Inoltre, bicelles può essere drogato con lipidi specifici che possono essere necessarie per la stabilità proteica o funzione.
4. Visualizzazione, estrazione di cristallo e il congelamento
In quanto le prove di cristallo con la proteina-bicelle miscela hanno una viscosità simile a quella proteina-detergente gocce, la visualizzazione e l'estrazione di cristallo è di routine e viene effettuato come i tradizionali set-up.
- Visualizzazione: A differenza dei media LCP che richiede spesso di alta qualità di illuminazione a luce normale e polarizzata per il rilevamento di cristallo, la visualizzazione non è ostacolato da bicelles. Colorati così come gocce di cristallo incolore proteine possono essere facilmente analizzati utilizzando microscopi standard e nessuna attrezzatura speciale è richiesta.
- Bicelles, come gli altri mezzi di comunicazione lipidico, tendono a produrre un'alta percentuale di falsi positivi. Un microscopio UV aiuta molto nel differenziare le proteine da cristalli di sale (Figura 4).
- Estrazione e di congelamento: estrazione di cristallo e il congelamento è relativamente semplice e non richiede dissoluzione dei media bicelle circostante. Inoltre, la fase bicelle stesso fornisce alcune moderato crio-protezione.
5. Rappresentante dei risultati:
nt "> Di solito, occorrono 2-3 giorni per i cristalli di apparire e di circa una settimana o più per loro di crescere fino alla loro dimensione massima. È il caso per batteriorodopsina e mouse voltaggio-dipendenti canale anionico 1 (mVDAC1) i cristalli 4,8 . Per altre proteine di membrana che può richiedere diverse settimane per la crescita dei cristalli, per cui è importante continuare a monitorare i processi di cristallo ben oltre le prime settimane.Come con altri mezzi di comunicazione lipidica, bicelles tendono a formare forme che possono sembrare cristallina. E 'stato inoltre osservato che conducono ad una maggiore percentuale di cristalli di sale e detergente. A UV-microscopio a fluorescenza che rileva triptofano può significativamente contribuire ad eliminare questi falsi positivi non proteinico. La figura 4 mostra forme di lipidi, sali e cristalli di proteine come si vede nella luce visibile e UV per aiutare a distinguere i diversi risultati che possono essere osservati.
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Figura 1. Bicelle schematica. Bicelles sono composti da una molecola di formare doppio strato lipidico, come DMPC (blu) e un amphiphile come CHAPSO (verde), che protegge i bordi idrofobica del doppio strato. Quando la temperatura è aumentata, disco-come bicelles subire una trasformazione di fase in un 12 lamiera lamellare.
Figura 2. Diagramma di flusso per il metodo di cristallizzazione bicelle che delinea le quattro fasi fondamentali.
Figura 3. Cristallo prove di set-up schematica. Purificato detergente-solubilizzato proteine di membrana può essere miscelato direttamente con bicelles su ghiaccio semplicemente pipettamento i contenuti insieme. Dopo l'incubazione della proteina / bicelle miscela in ghiaccio per circa 30 minuti, prove di cristallizzazionepuò essere configurato con tutti i formati standard, tra cui la robotica.
Figura 4. Visualizzazione di prove cristallo. Immagine visibile (pannello superiore) e l'immagine ai raggi UV (pannello inferiore) di (A) Ago a forma di cristalli di sale, osservata in un solo stato. Fluorescenza non possono essere rilevati dai cristalli, l'indicazione di falsi positivi. (B) Rod a forma di cristallo formato in una condizione di MPD. Il cristallo fluorescente debolmente, ma è risultato essere non-proteici con diffrazione di raggi X. (C) Cristallo osservato circa quattro settimane dopo la creazione di prove. La forte fluorescenza ai raggi UV conferma si tratta di un cristallo di proteina.
| No. | Proteina | Fonte | Bicelle Formulazione | Concentrati di proteinesu | Detergente 1 | Risoluzione (Å) | Riferimento |
| 1 | Batteriorodopsina 2 | Halobacterium salinarum | 8% DMPC: CHAPSO (2.8:1) | 8 mg / ml | 2,0 | Faham e Bowie, 2002 | |
| 8% DTPC: CHAPSO (3:1) | 8 mg / ml | 1,8 | Faham et al., 2005 | ||||
| 2 | β2-recettori adrenergici / complesso Fab | Homo sapiens | 8,3% DMPC: CHAPSO (3:1) | 10 mg / ml | DDM | 3.4/3.7 | Rasmussen et al., 2007 |
| 3 | Voltaggio-dipendenti canale anionico 1 | Mus musculus | 7% DMPC: CHAPSO (2.8:1) | 12 mg / ml | LDAO | 2,3 | Ujwal et al., 2008 |
| 4 | Xanthorhodopsin | Salinibacter ruber | 4,2% DMPC, 5% NM | 4 mg / ml | DDM | 1,9 | Luecke et al., 2009 |
| 5 | Romboidale della proteasi | Escherichia coli | 2% DMPC: CHAPSO (2.6:1) | 9 mg / ml | Glucoside nonil | 1,7 | Vinothkumar, 2011 |
1 detergente usato per la purificazione delle proteine di membrana
2 lipidi native da membrane viola può essere effettuato lungo durante la purificazione
Tabella 1. Sintesi delle condizioni di cristallizzazione per le strutture di proteina di membrana risolto utilizzando bicelles.
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Discussion
Bicelles sono un media unico lipidico che offrono un nativo doppio strato, come l'ambiente mentre si comportano come se solubilizzato da detergenti. Questa proprietà dà bicelles un netto vantaggio rispetto ad altre a base di lipidi metodi di cristallizzazione in quanto non vi è alcuna curva di apprendimento o di attrezzature specialistiche richieste per questa tecnica. Una volta bicelles sono disponibili, siano esse commerciali o preparati in laboratorio, possono essere miscelato direttamente con proteine purificate e da questo punto in poi le prove di cristallizzazione quasi esattamente come procedere con i protocolli standard in base detergente. Inoltre, bicelles offrono diversi vantaggi pratici rispetto ad altre tecniche, compresi i periodi di stoccaggio prolungato, semplice incorporazione di proteine, ad alta produttività con funzionalità standard di robotica e la visualizzazione di routine e l'estrazione di cristallo. Un altro vantaggio è la possibilità di bicelles droga con i lipidi specifici per l'ottimizzazione o se dimostrato benefico per la proteina di interesse. Nel loro insieme, i lipidic metodo bicelle offre una notevole versatilità in combinazione con pratiche facilità d'uso, che lo rende facilmente adottabile per tutti i progetti cristallizzazione delle proteine della membrana.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Drs. James Bowie e Salem Faham per la fornitura di competenze tecniche e linee guida sul metodo bicelle e il Dr. Aviv Paz per le discussioni utili. Riconosciamo Le Du per il supporto sperimentale. Rachna Ujwal ha interessi finanziari in MemX Biosciences LLC, che, tuttavia, non ha supportato questo lavoro. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalle concessioni dal NIH (RO1 GM078844).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMPC | Affymetrix | D514 | |
| CHAPSO | Affymetrix | C317 | |
| Ready-to-use Bicelles | MemX Biosciences | MX201001/MX201002 | |
| Crystallization Screens | Qiagen, Hamptop Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience | Standard commercially available screens can be used for initial screening | |
| Crystallization Set-up | Standard manual and/or robotic set-up available in lab can be used. |
References
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