Name: High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Erfahren Sie die Hochdurchsatzkristallisation von Membranproteinen mit der lipidischen Bicellen-Methode. Diese Technik ermöglicht die Einbettung von Proteinen in ein Lipidmedium und erleichtert die Kristallisation mit Standardlaborausrüstung.

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Wir möchten Drs danken. James Bowie und Salem Faham für die technische Expertise und Beratung über die Bicellen Methode und Dr. Aviv Paz für hilfreiche Diskussionen. Wir erkennen Le Du für experimentelle Unterstützung. Rachna Ujwal hat finanzielles Interesse an MemX Biosciences LLC, die jedoch nicht unterstützen diese Arbeit. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse der NIH (RO1 GM078844) unterstützt.

I) Vorbereitung einer Bicellen Lipid: Bicellen Basis Kristallisation von vier grundlegenden Schritten (Abbildung 2) besteht; ii) der Einbau von gereinigtem Protein in die Bicellen Medium; iii) Kristallisation Studien (manuell oder maschinell); amphiphile Mischung und iv) Visualisierung, Kristall-Extraktion und Einfrieren. Diese Schritte werden im Folgenden detailliert beschrieben 1. Vorbereitung der Bicellen Amphiphile Kombinationen und über einen weiten Konzentrationsbereich: Bicellen können in einer Vielzahl von Lipid zu bilden. Daher ist Konditionen-eine anfängliche Zusammensetzung-Basis von früheren, erfolgreichen empfohlen (Tabelle 1). Die gelungene Mischung ist der DMPC: CHAPSO Bicellen Formulierung, die entweder gekauft werden kommerziell als vorgemischte ready-to-use Formulierung (siehe Tabelle der Reagenzien unten) oder vorbereitet in das Labor, wie beschrieben. CHAPSO Mischung bei einer 2,8:1 Molverhältnis: Bei dieser Übung werden wir 1 ml 35% DMPC vorzubereiten. <ol><li abwiegen g dmpc mol chapso und f deionisiertem wasser auf ein endvolumen von ml. type="disc"><li> Die Bicellen Prozentsatz zwischen 10% -40% mit variieren DMPC: CHAPSO Molverhältnis von 2.6-3.0:1 (Tabelle 1). </li><li> Hinweis: Je höher die Konzentration der Bicellen desto schwieriger ist es mit dem Lipid was zu einer höheren Viskosität der Lösung auflösen. Allerdings kann eine konzentrierte Bicellen Formulierung vorteilhaft sein, wenn die Protein-Konzentration niedrig ist. </li><li> Lösen des Lipid, um eine homogene Lösung zu erhalten erfordert erhebliche Anstrengungen, so dass dieser Schritt die meiste Zeit in Anspruch in der Bicellen Methode. Radeln Sie durch die folgenden Schritte, bis die DMPC ist völlig gemischt: <ol><li> Wärmen Sie die Mischung auf ~ 40 ° C mit einem Wasserbad oder einem Inkubator und Wirbel für ~ 1 Minute. <ul type="disc"><li> Hinweis: Da mehrere Zyklen durchgeführt werden, die Erwärmung der Mischung in eine gelartige con ErgebnisKonsistenz macht es schwierig, Wirbel. </li></ul></li><li> Das Gemisch wird auf Eis und Wirbel für ein paar Minuten. Kühlung hilft verflüssigen die Lösung macht es einfacher, Wirbel. <ul type="disc"><li> Hinweis: Da mehrere Zyklen durchgeführt werden, kann die Mischung beim Abkühlen trübe. </li></ul></li><li> Wiederholen Sie die oben aufgeführten Schritte (1.2.1 und 1.2.2), bis die Lipid vollständig gelöst ist. <ul type="disc"><li> Hinweis: Dieser Vorgang kann mehrere Stunden dauern. CHAPSO Formulierung: Bicellen Bildung wird durch die Änderungen in Phasenverhalten des DMPC angegeben. Nach der Fertigstellung wird die Mischung ein klares Gel auf oder oberhalb der Raumtemperatur und einer viskosen Flüssigkeit auf Eis. </li></ul></li></ol></li><li> Die Bicellen Mischung ist nun einsatzbereit und kann bei -20 ° C für eine langfristige Lagerung (bis 5 Jahre) gehalten werden. Wegen der Gefahr der Hydrolyse der Phospholipid-Kopfgruppe, ist es nicht ratsam, Bicellen bei Raumtemperatur zu lagern für längere Zeit. </li></ol> 2. Der Einbau von Protein in Bicellen Die meisten MP Strukturen aus Bicellen erhalten wurden in DMPC kristallisiert: CHAPSO Bicellen Konzentration im Bereich von 2 bis 8% mit einer Proteinkonzentration von 8 bis 12 mg / ml (Tabelle 1). Wenn möglich, sollte Einstiegsbildern nutzen diese Richtlinien sowie die Konzentrationen können bei der Optimierung der Bühne zu sehen sein. Im Vergleich zu den LCP-Verfahren wird das Protein Aufnahme mit Bicellen ein einfacher Prozess (Abbildung 3), die am selben Tag sollte die Kristallisation Studien sein. <ol><li> Auftauen DMPC: CHAPSO Bicellen Mischung bei Raumtemperatur, bis die Phase Änderungen ein klares Gel. <ul type="disc"><li> Hinweis: Mehrere Frost-Tauwetter wirkt sich nicht auf Bicellen Verhalten. </li></ul></li><li> Legen Sie die Mischung auf Eis zu verflüssigen und kurz vortexen, um eine homogene Bicellen Phase wieder herzustellen. Wenn auf Eis gelegt, kann die Mischung trübe. </li><li> From diesem Punkt an, halten Sie die Bicellen Mischung und gereinigtes Protein auf Eis. Dies wird die Bicellen in einer flüssigen Phase macht es zugänglich Pipettieren zu halten. </li><li> Fügen Sie die Bicellen Mischung auf das gereinigte Detergenz-solubilisierten Proteins in einem 1:4 (V / V)-Verhältnis. <ul type="disc"><li> Zum Beispiel: 100 ul Protein-Bicellen Mischung wird durch Mischen von 80 ul Protein mit 20 ul Bicellen erhalten. Wenn die Protein-Konzentration beträgt 15 mg / ml und die Konzentration Bicellen beträgt 35%, wird dies ein Bicellen-integriert Proteinmischung mit einer Proteinkonzentration von 12 mg / ml und eine Bicellen Konzentration von 7% zu geben. </li></ul></li><li> Durch vorsichtiges Pipettieren den Inhalt auf und ab, bis die Lösung klar und homogen. <ul type="disc"><li> Hinweis: Wenn Blasen erscheinen, eine schnelle Runde (30-60 Sekunden, 13000 rpm, 4 ° C) mit einer Tischzentrifuge können sie entfernen. </li></ul></li><li> Inkubieren Sie die Mischung auf Eis für mindestens 30 min, um vollständige Einbindung von Protein int förderno Bicellen. Die Protein-Bicellen Mischung ist nun bereit für die Kristallisation Studien. </li></ol> 3. Einrichten Kristallisation Studien Weitere Lipid-Kristallisation Techniken wie die LCP erfordern eine spezielle Ausrüstung durch das Medium der hohen Viskosität, aber die einzigartige Phasenverhalten Bicellen ermöglicht die Umsetzung in praktisch jeder Standard-Kristallisation Format, einschließlich Robotik (Abbildung 3). Kristallisation Studien können entweder in hängenden oder sitzenden Tropfen Formate mit handelsüblichen Bildschirmen durchgeführt werden. <ol><li> Ob die Einrichtung Trays manuell oder mit Hilfe eines Roboters Kristallisation, zur Erhaltung des Protein-Bicellen Mischung auf Eis. Dies hält die Protein-Bicellen Mischung kalt und sicherzustellen, dass die Viskosität der Lösung ist minimal. </li><li> Manuelle Kristallisation Trials - Mit einem Standard-Pipette, kann das Protein-Bicellen Mischung mit Reservoir-Lösung in der gleichen Weise vermischt werden als normal funktionierened für lösliche oder Reinigungsmittel-solubilisierten Membranproteinen. <ul type="disc"><li> Hinweis: Bewahren Sie die Protein-Bicellen Mischung auf Eis während der Studien. </li></ul></li><li> Robotic Kristallisation Trials - Wir haben diese Studien für die Mosquito Kristallisation Roboter zugeschnitten sind, aber im Prinzip (nach dem gleichen Vorsichtsmaßnahmen) die Technik soll kompatibel mit allen Kristallisation Roboter. Die folgenden Tipps sollen sicherstellen, dass die Protein-Mischung Bicellen kühl bleibt und genau durch den Roboter pipettiert: <ol><li> Vorkühlung der Platte hält die Protein-Mischung Bicellen indem man sie auf Eis. </li><li> Pipette das Protein-Bicellen Mischung in der Platte und weiter auf die Platte auf Eis halten. Diese Platte sollte der letzte Punkt, auf den Roboter vor Beginn der Ausführung zu gehen. </li><li> Set-up das Reservoir-Fach und Kristallisation Deckel auf der Plattform 3 und 5 jeweils der Mücke Roboter. </li><li> Die Platte enthält Protein-Bicellen Mischung auf Gleis 4der Mücke Roboter. Dadurch ist gewährleistet, das Protein-Bicellen Mischung ist der letzte, von dem Roboter aufgenommen und es wird sofort entlassen. </li><li> Um zu verhindern, Heizung und erhöhter Viskosität, nicht zu verwechseln das Reservoir mit dem Protein-Bicellen Mischung. </li><li> Bei der Durchführung von mehreren Bildschirmen, sofort wieder die Bicellen-Protein-Platte auf Eis für die Kühlung, sobald ein Durchlauf beendet ist. </li></ol></li><li> Tropfenvolumentensiometer und Verhältnis (Protein: Reservoir) kann als bei herkömmlichen Kristallisation Studien gewählt werden. Zum Beispiel können erste Kristall-Studien mit dem Mosquito Roboter eingerichtet werden mit 0,25 ul Protein: Bicellen Mischung plus 0,25 ul Reservoir. </li><li> Inkubieren Sie die Kristall-Studien in einer Kammer bei 20 ° C. Die Temperatur ist ein guter Screening und Optimierung Parameter, da das Phasenverhalten Bicellen ist temperaturabhängig. <ul type="disc"><li> Höhere Temperaturen verursachen die lamellare Phase 12 (Abbildung 1), die den Vorteil der Pre-Organisation hatdas Protein in Schichten. Temperaturen unter 20 ° C kann abgeschirmt werden, aber man sollte nicht unter 4 ° C, da dies die Lipide zu fällen führen über längere Zeiträume. </li></ul></li><li> In der gleichen Weise wie herkömmliche Kristallisation Studien sollten Bicellen Studien auf einer regulären Basis für Kristall-Optik und das Wachstum überwacht werden. Wir empfehlen die Schalen auf den 1. und 3. Tag nach dem Setup durch wöchentliche Kontrolle folgte überprüfen. </li><li> Kristall-Optimierung durchgeführt werden kann mit Methoden routinemäßig für Waschmittel Kristalle einschließlich Grid-Screening, Additiv-Screening, wechselnde Temperaturen etc. Zusätzlich Bicellen Prozentsatz und Protein verwendet: Bicellen Verhältnis variiert werden kann. Darüber hinaus können Bicellen mit spezifischen Lipiden, die notwendig für die Stabilität des Proteins oder Funktion kann dotiert sein. </li></ol> 4. Visualisierung, Kristall-Extraktion und Gefrieren Seit Kristall Studien mit dem Protein-Mischung Bicellen eine Viskosität ähnlich Protein-Detergenz Tropfen-, Visualisierungs-und Kristall-Extraktion ist Routine und wird wie herkömmliche Set-ups durchgeführt. <ol><li> Visualisierung: Im Gegensatz zu LCP Medien, erfordert oft hochwertige Beleuchtung unter normalen und polarisiertem Licht für Kristall-Erkennung, Visualisierung wird nicht durch Bicellen behindert. Farbige sowie farblos Proteinkristall Tropfen können leicht analysiert werden mit Standard-Mikroskope und keine besondere Ausrüstung erforderlich ist. </li><li> Bicellen, wie andere Lipid-Medien neigen dazu, einen hohen Prozentsatz der Fehlalarme zu erzeugen. Ein UV-Mikroskop hilft enorm bei der Differenzierung von Protein aus Salzkristallen (Abbildung 4). </li><li> Extraktion und Gefrieren: Crystal Gewinnung und Einfrieren ist relativ einfach und erfordert keine Auflösung der umgebenden Bicellen Medien. Darüber hinaus bietet die Bicellen Phase selbst einige moderate Kryo-Schutz. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: nt "&gt; Es dauert in der Regel 2-3 Tage nach Kristallen zu erscheinen und etwa eine Woche oder mehr für sie, um ihre maximale Größe wachsen. Dies war der Fall für Bakteriorhodopsin und Maus voltage-dependent Anion Channel 1 (mVDAC1) Kristalle 4,8 . Für andere Membranproteine ​​kann es mehrere Wochen dauern, für das Kristallwachstum, so ist es wichtig, weiterhin die Überwachung der Kristall-Studien weit über die ersten Wochen. Wie bei anderen fetthaltigen Medien neigen Bicellen zu Formen, die zu sein scheinen kristalline bilden können. Es wurde auch beobachtet, dass sie einen höheren Anteil an Salz und Spülmittel Kristalle führen. Ein UV-Mikroskop, das Tryptophan-Fluoreszenz detektiert kann erheblich dazu beitragen, zu eliminieren, wie nicht-proteinhaltigen Fehlalarme. Abbildung 4 zeigt Lipid Formen, Salz und Protein-Kristalle als im sichtbaren und UV-Licht betrachtet, um zu unterscheiden die verschiedenen Ergebnisse, die beobachtet werden können. 83fig1.jpg "/&gt; Abbildung 1. Bicellen Schematische. Bicellen sind von einer Doppelschicht Lipid-Molekül wie DMPC (blau) und ein Amphiphil wie CHAPSO (grün), welche die hydrophoben Kanten der Doppelschicht schützt zusammen. Da die Temperatur erhöht wird, durchlaufen Disc-like Bicellen eine Phasenumwandlung in eine perforierte Lamellen-Blatt 12. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Flowchart für die Bicellen Kristallisationsverfahren, in der die vier grundlegenden Schritten. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Kristall Studien set-up schematisch. Gereinigtes Detergenz-solubilisierten Membranproteinen können direkt mit Bicellen auf Eis durch einfaches Pipettieren den Inhalt vermischt. Nach Inkubation der Protein / Bicellen Mischung auf Eis ~ 30 Minuten, Kristallisation Studienkann so eingerichtet werden mit einem beliebigen Standard-Format, einschließlich Robotik. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Visualisierung von Kristall-Studien. Sichtbares Bild (oben) und UV-Bild (unten) von (A) nadelförmige Kristalle in einem Salz-only Zustand beobachtet. Keine Fluoreszenz kann von den Kristallen nachgewiesen werden, ein Hinweis auf falsch positive. (B) stabförmige Kristalle gebildet in einem MPD Zustand. Der Kristall fluoresziert schwach, aber erwies sich als nicht-proteinhaltigen mit Röntgenbeugung. (C) Crystal etwa vier Wochen nach dem Einrichten Studien beobachtet. Die starke Fluoreszenz unter UV-Licht bestätigt es ist ein Protein-Kristall. <table border="1"><tbody><tr><td> Nein. </td><td> Protein </td><td> Quelle </td><td> Bicellen Formulation </td><td> Protein Concentratiauf </td><td> Detergens 1 </td><td> Auflösung (A) </td><td> Referenz </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Bacteriorhodopsin 2 </td><td> Halobacterium salinarum </td><td> 8% DMPC: CHAPSO (2,8:1) </td><td> 8 mg / ml </td><td></td><td> 2,0 </td><td> Faham und Bowie, 2002 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 8% DTPC: CHAPSO (3:1) </td><td> 8 mg / ml </td><td></td><td> 1,8 </td><td> Faham et al., 2005 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> β2-adrenergen Rezeptor / Fab-Komplex </td><td> Homo sapiens </td><td> 8,3% DMPC: CHAPSO (3:1) </td><td> 10 mg / ml </td><td> DDM </td><td> 3.4/3.7 </td><td> Rasmussen et al., 2007 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Voltage-dependent Anion Kanal 1 </td><td> Mus musculus </td><td> 7% DMPC: CHAPSO (2,8:1) </td><td> 12 mg / ml </td><td> LDAO </td><td> 2,3 </td><td> Ujwal et al., 2008 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Xanthorhodopsin </td><td> Salinibacter ruber </td><td> 4,2% DMPC, 5% NM </td><td> 4 mg / ml </td><td> DDM </td><td> 1,9 </td><td> Luecke et al., 2009 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Rhomboid Protease </td><td> Escherichia coli </td><td> 2% DMPC: CHAPSO (2,6:1) </td><td> 9 mg / ml </td><td> Nonyl Glucosid </td><td> 1,7 </td><td> Vinothkumar, 2011 </td></tr></tbody></table> 1-Waschmittelformulierungen für Membran-Protein-Aufreinigung verwendet 2 native Lipide aus Purpurmembranen kann entlang während der Reinigung durchgeführt werden Tabelle 1. Zusammenfassung der Kristallisationsbedingungen für Membran-Protein-Strukturen gelöst mit Bicellen.

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<li>Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetically+aligned+phospholipid+bilayers+with+positive+ordering%3A+a+new+model+membrane+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system.</a> Biophys. J. 74, 2405-2418 (1998).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Bicellen sind eine einzigartige Lipid-Medien, die eine native Doppelschicht-ähnliche Umgebung bieten und gleichzeitig verhalten, als ob durch Detergenzien solubilisiert. Diese Eigenschaft verleiht Bicellen einen entscheidenden Vorteil gegenüber anderen Lipid-basierte Kristallisationsverfahren, da es keine Lernkurve oder spezielle Geräte für diese Technik erforderlich. Sobald Bicellen verfügbar sind, weder zu kommerziellen oder vorbereitet in das Labor, können sie direkt gemischt mit gereinigtem Protein und von diesem Pu...

high-throughput-kristallisation von membranproteinen mit dem lipidische bicellen methode

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membranproteine ​​(MPs) spielen eine entscheidende Rolle in vielen physiologischen Prozessen wie Pumpen spezifische Moleküle durch die ansonsten undurchlässige Membran-Doppelschicht, dass alle Zellen und Organellen umgibt. Änderungen in der Funktion des Abgeordneten führen in vielen menschlichen Krankheiten und Störungen, daher bleibt ein komplexes Verständnis ihrer Strukturen eine entscheidende Ziel für die biologische Forschung. Allerdings bleibt die Strukturbestimmung der Abgeordneten eine große Herausforderung oft aus ihrer Hydrophobizität. Abgeordnete haben erhebliche hydrophobe Regionen innerhalb der Doppelschicht eingebettet. Reinigungsmittel werden häufig verwendet, um diese Proteine ​​aus der Doppelschicht erzeugt ein Protein-Detergenz Mizellen, die dann in ähnlicher Weise als lösliche Proteine ​​manipuliert werden können aufzulösen. Traditionell gehen Kristallisation Studien mit einem Protein-Waschmittel-Gemisch, aber oft widerstehen Kristallisation oder erzeugen Kristalle von schlechter Qualität. Diese Probleme entstehen aufgrund derReinigungsmittel in der Lage ist, angemessen imitieren die Doppelschicht zu einer schlechten Stabilität und Heterogenität. Darüber hinaus das Waschmittel schirmt die hydrophobe Oberfläche des MP Reduzierung der Fläche für Kristall-Kontakte. Zur Umgehung dieser Nachteile Abgeordnete kann in Lipid-Medien, die eine bessere Simulation ihrer endogenen Umgebung kristallisiert werden, und hat vor kurzem zu einem de novo-Technik für MP Kristallisation. Lipidische kubische Phase (LCP) ist ein dreidimensionales Lipiddoppelschicht durch ein vernetztes System von wässrigen Kanäle 1 eingedrungen. Obwohl Monoolein ist das Lipid der Wahl haben Lipide wie monopalmitolein und monovaccenin auch genutzt, um LCP 2 zu machen. Abgeordnete werden in das LCP, wo sie in drei Dimensionen und Futtermitteln Kristallkeime diffuse eingearbeitet. Ein großer Vorteil des LCP ist, dass das Protein in einer nativen Umgebung bleibt, aber die Methode hat eine Reihe von technischen Nachteilen einschließlich High viscosity (erfordert spezialisierte Einrichtungen) und Schwierigkeiten bei der Kristall-Visualisierung und Manipulation 3,4. Aufgrund dieser technischen Schwierigkeiten, verwendeten wir eine andere Lipid-Medium für die Kristallisation-Bicellen 5,6 (Abbildung 1). Bicellen sind Lipid / amphiphile Mischungen hergestellt, indem ein Phosphatidylcholin Lipid (DMPC) mit einem Amphiphil (CHAPSO) oder eine kurzkettige Lipid (DHPC) gebildet. Innerhalb der einzelnen Bicellen Disc erzeugen die Lipid-Moleküle eine Doppelschicht, während die amphiphile Moleküle Linie der apolaren Ecken für eine vorteilhafte Eigenschaften der beiden Doppelschichten und Waschmittel. Wichtig ist, dass unter ihrer Sprungtemperatur haben Protein-Bicellen Mischungen eine reduzierte Viskosität und sind in einer ähnlichen Weise wie Waschmittel-solubilisierten Abgeordnete manipuliert, so dass Bicellen kompatibel mit Kristallisation Roboter. Bicellen wurden erfolgreich eingesetzt, um kristallisieren verschiedene Membranproteine ​​5,7-11 (Tabelle 1). Diese wachsende Sammlungvon Proteinen demonstriert die Vielseitigkeit des Bicellen zur Kristallisation sowohl alpha Helix und beta-Faltblatt Abgeordneten aus prokaryotischen und eukaryotischen Quellen. Aufgrund dieser Erfolge und der Einfachheit der High-Throughput-Umsetzung sollte Bicellen Bestandteil jedes Membranprotein Kristallographen Arsenal sein. In diesem Video beschreiben wir die Bicellen Methodik und bieten eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für den Aufbau High-Throughput-Kristallisation Studien von gereinigtem MPs mit Standard-Robotik.

Bicellen sind Lipid / amphiphile Mischungen, die Membranproteine ​​(MPs) halten in einer Lipid-Doppelschicht, sondern verfügen über einzigartige Phase Verhalten, das High-Throughput-Screening ermöglicht durch Kristallisation Roboter. Diese Technik hat erfolgreich eine Reihe von hochaufgelösten Strukturen von prokaryotischen und eukaryotischen Quellen erzeugt. Dieses Video beschreibt Protokolle zur Erzeugung der Lipid-Bicellen Mischung unter Einbeziehung Abgeordneten in die Bicellen Mischung, die Einrichtung von Kristallisationen Studien (sowohl manuell als auch maschinell) und Ernte-Kristalle aus dem Medium.

High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode

Membranproteine (MPs) spielen eine entscheidende Rolle in vielen physiologischen Prozessen, wie beispielsweise beim Pumpen spezifischer Moleküle durch die ansonsten undurchlässige Membran ...

Dieses Video demonstriert ein Verfahren zur Einrichtung von Hochdurchsatz-Kristallisationsversuchen mit gereinigten Membranproteinen unter Verwendung von Lipic-B-Zellen. Zunächst werden B-Zellen durch Mischen eines Lipids und eines Detergens hergestellt, wobei das gereinigte Membranprotein in die B-Zell-Mischung eingebaut wird, und anschließend werden Kristallisationsversuche mithilfe eines Nanoliter-Roboters und visueller Inspektion durchgeführt. Die Verwendung eines Standard-Lichtmikroskops zeigt das Vorhandensein von Kristallen an.Nach der Bildung können die Protein-Kristalle entnommen und zum Datensammeln sowie zur Strukturbestimmung eingefroren werden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass aufgrund des einzigartigen Phasenverhaltens von B-Zellen Standardgeräte und im Labor verfügbare Robotik für die Kristallisation genutzt werden können. Die Einrichtung von B-Zellen ist eine so einfache Technik, dass sie es ermöglicht, das Zielmembranprotein aus dem detergenzhaltigen Milieu zu entfernen und in ein lipidbasiertes Medium zu überführen.Dies liefert Ihnen einen völlig neuen Satz von Bedingungen für die Bildschirmanalyse. Es handelt sich um eine so einfache Methode, die

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hierin ist das Verfahren in der Caffrey Membrane Strukturelle und funktionelle Biology Group manuell einrichten Kristallisation Studien von Membranproteinen in lipidic Mesophasen implementiert beschrieben.

Crystallizing Membranproteinen zur Strukturaufklärung mittels Lipidische Mesophasen

Auswertung zweidimensionaler (2D) Kristallisation Studien für die Bildung geordneter membrane protein-Arrays ist eine höchst kritische und schwierige Aufgabe in Elektronenkristallographie. Hier beschreiben wir unseren Ansatz in Screening und Identifizierung von 2D-Kristallen von überwiegend kleinen Membranproteine ​​im Bereich von 15 - 90kDa.

Die Beurteilung Zweidimensionale Kristallisation Trials of Small Membranproteinen für Strukturbiologie Studien Electron Crystallography

Die Protokolle beschreiben die wesentlichen Schritte für den Erhalt Beugung Qualität Kristalle von Membranproteinen ab Rekonstitution des Proteins in einer Lipid-kubische Phase (LCP), finden Anfangsbedingungen mit LCP-FRAP Vorkristallisation Assays, die Einrichtung von LCP Kristallisation Studien und Ernte-Kristallen .

Die Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

Hierin wird eine Roboter-Ansatz zur Hochdurchsatz-Kristallisation von Membranproteinen in lipidische Mesophasen zur Verwendung in Strukturbestimmung mittels makromolekularen Röntgenkristallographie beschrieben. Drei Roboter in der Lage Umgang mit dem viskosen und klebrigen Protein-beladenen Mesophase integraler Bestandteil der Methode eingeführt werden.

Einsatz eines Roboters für High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen

β-barrel outer membrane proteins (OMPs) erfüllen viele Funktionen innerhalb der äußeren Membranen von gramnegativen Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten. Hier hoffen wir, einen bekannten Engpass in Strukturstudien zu entschärfen, indem wir Protokolle für die Herstellung von β-Zylinder-OMPs in ausreichender Menge für die Strukturbestimmung mittels Röntgenkristallographie oder NMR-Spektroskopie vorstellen.

Von Konstrukten Crystals - Auf dem Weg zu Strukturbestimmung von β-Fass-Außenmembranproteine

Lipidmonoschichten werden seit Jahrzehnten als Grundlage für die Bildung von zweidimensionalen (2D) Proteinkristallen für Strukturstudien verwendet. Sie sind an der Luft-Wasser-Grenzfläche stabil und können als dünnes Trägermaterial für die Elektronenbildgebung dienen. Hier stellen wir die bewährten Schritte zur Herstellung von Lipidmonolayern für biologische Studien vor.

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GFP-Fusionsproteine ​​sind weit verbreitet, um Organellen durch konfokale Mikroskopie sichtbar zu machen. Allerdings Screening auf Mutationen, die die Morphologie der Organellen beeinflussen erfordert in der Regel individuelle Mutagenese und zeitaufwändig ist. Hier zeigen wir eine Methode, um gleichzeitig aufzunehmen Organellen-GFP-Marker in fast 5.000 Nicht-essentielle Gene in Hefe.

Ein High-Throughput-Verfahren zur global Studie der Organellen-Morphologie in S. cerevisiae

Hierin wird Verfahren im Caffrey Membrane Strukturelle und Funktionelle Biology Group zu ernten und Kryo-cool Membranprotein Kristalle in Lipid kubische und Schwamm Phasen für den Einsatz in der Struktur-Bestimmung mit makromolekularen Röntgenkristallographie gewachsen implementiert beschrieben.

Ernte-und Cryo-Kühlung Kristalle von Membranproteinen in Lipidische Mesophasen zur Strukturaufklärung von Makromolekulare Kristallographie Grown

Erfahren Sie die Hochdurchsatzkristallisation von Membranproteinen mit der lipidischen Bicellen-Methode. Diese Technik ermöglicht die Einbettung von Proteinen in ein Lipidmedium und erleichtert die Kristallisation mit Standardlaborausrüstung.

High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode

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