High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode
January 9th, 2012
Bicellen sind Lipid / amphiphile Mischungen, die Membranproteine (MPs) halten in einer Lipid-Doppelschicht, sondern verfügen über einzigartige Phase Verhalten, das High-Throughput-Screening ermöglicht durch Kristallisation Roboter. Diese Technik hat erfolgreich eine Reihe von hochaufgelösten Strukturen von prokaryotischen und eukaryotischen Quellen erzeugt. Dieses Video beschreibt Protokolle zur Erzeugung der Lipid-Bicellen Mischung unter Einbeziehung Abgeordneten in die Bicellen Mischung, die Einrichtung von Kristalli
Dieses Video zeigt eine Methode zum Aufbau von Hochdurchsatz-Kristallisationsversuchen von gereinigten Membranproteinen unter Verwendung von Lipic B-Zellen. Zuerst werden B-Zellen durch Mischen eines Lipids und eines Detergens hergestellt, gereinigtes Membranprotein wird in die B-Zellmischung eingebaut und Kristallisationsversuche werden mit einer visuellen Inspektion eines Nanoliter-Roboters durchgeführt. Die Verwendung eines Standard-Lichtmikroskops zeigt das Vorhandensein von Kristallen.
Einmal gebildet, können die Proteinkristalle extrahiert und eingefroren werden, um Daten zu sammeln und strukturiert zu bestimmen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass aufgrund des einzigartigen Phasenverhaltens von B-Zellen die im Labor verfügbaren Standardgeräte und Robotik für die Kristallisation verwendet werden können. Das Einrichten von B-Zellen ist eine so einfache Technik, die es Ihnen ermöglicht, Ihr Zielmembranprotein aus dem Detergens meiner Zelle zu nehmen und es in ein liptisches Medium zu legen.
Dadurch erhalten Sie völlig neue Bedingungen, die Sie überprüfen können. Es ist eine so einfache Methode, die erfolgreich auf viele Membranproteine angewendet wurde, dass es einfach keinen Grund gibt, sie nicht auszuprobieren. Der erste Schritt bei der B-Zell-basierten Kristallisation ist die Herstellung einer B-Zell-bildenden Lipid-Amphi-Mischung.
Dieser Prozess erfordert einen erheblichen Aufwand und ist am zeitaufwändigsten. Beachten Sie, dass der Vorgang mehrere Stunden dauern kann. B-Zellen können sich in einer Vielzahl von Lipid-Amphi-Kombinationen und über einen weiten Konzentrationsbereich bilden.
Empfohlene Ausgangspunkte finden Sie in Tabelle eins im begleitenden schriftlichen Protokoll: Beginnen Sie mit der Zubereitung eines Milliliters einer 35%igen DMPC-Capso-Mischung in einem Verhältnis von 2,8 zu einem molaren Verhältnis. Wiegen Sie dazu 0,26 Gramm DMPC und 0,09 Gramm Chapo in einer Tube ab. Bringen Sie das Volumen auf 1,0 Milliliter mit entionisiertem Wasser und wirbeln Sie die Mischung ein.
Anschließend erwärmst du die Mischung in einem Wasserbad auf etwa 40 Grad Celsius, bis sie danach gelartig wird. Lege das Rohr auf Eis. Die Probe sollte wieder flüssig werden.
Wirbeln Sie dann erneut einige Minuten lang vor und durchlaufen Sie die Erwärmungs-, Kühl- und Vortex-Schritte, bis sich das Lipid vollständig aufgelöst hat. Beachten Sie, dass die Mischung nach Beendigung des Abkühlens trüb werden kann, wenn mehr Zyklen durchgeführt werden. Die Mischung ist ein klares Gel bei oder über Raumtemperatur, und eine viskose Flüssigkeit auf Eis von Zellen kann zur Langzeitlagerung bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.
Als nächstes werden gereinigte Proteine in das B-Zell-Medium eingebaut. Dies ist ein einfacher Vorgang und sollte am selben Tag wie die Kristallisation durchgeführt werden, die im nächsten Abschnitt des Videos gezeigt wird. Tauen Sie das DMPC-Capso-B-Zellgemisch bei Raumtemperatur auf, bis die Phase in ein klares Gel übergeht.
Lege die Mischung auf Eis, um sie zu verflüssigen, und wirbele sie dann kurz vortexen, um wieder eine homogene B-Zell-Phase herzustellen. Bewahren Sie ab diesem Zeitpunkt die B-Zell-Mischung und das gereinigte Protein auf Eis auf. Dadurch wird die B-Zelle in einer flüssigen Phase gehalten, wodurch sie für das Pipettieren geeignet ist.
Als nächstes fügen Sie die B-Zell-Mischung zu dem gereinigten solubilisierten Detergenzienprotein in einem Verhältnis von eins zu vier hinzu, Volumen zu Volumen. Pipettieren Sie dann vorsichtig auf und ab, bis die Lösung klar und homogen wird. Wenn Blasen auftreten, drehen Sie sie kurz in einer Tischzentrifuge nach unten.
Inkubieren Sie die Mischung mindestens 30 Minuten lang auf Eis, um den vollständigen Einbau des Proteins in die Zellen zu fördern. Das Protein-für-Zell-Gemisch ist nun bereit für Kristallisationsversuche. Kristallisationsversuche werden mit einem Mückenkristallisationsroboter demonstriert.
Kühlen, eine 96 Well V Bodenplatte, indem Sie sie auf Eis legen. Pipettieren Sie das Protein nach Zellmischung in die Platte, um sicherzustellen, dass die Viskosität der Lösung minimal ist. Bewahren Sie die Protein-für-Zell-Mischung bis zum letzten Schritt auf Eis auf.
Der hier eingesetzte Roboter verfügt über fünf Plattformen. Platzieren Sie die Mikroplatte mit dem Reservoir auf Plattform drei und den Kristallisationsdeckel, auf den die Tropfen abgegeben werden, auf Plattform fünf. Platzieren Sie dann das Protein auf der Zellplatte auf der Plattform vier, die der Abgabeposition am nächsten liegt.
Dadurch wird sichergestellt, dass das Protein für Zellgemisch als letztes vom Roboter aufgenommen und sofort freigesetzt wird. Mit der Software, die den Lauf einleitet, nimmt der Roboter die Reservoirlösung auf, gefolgt von der Protein-Zell-Mischung und gibt sie als Tropfen auf den Deckel ab, um eine Erwärmung und eine erhöhte Viskosität während der Abgabe zu verhindern. Programmieren Sie die Mücke nicht so, dass sie das Reservoir mit dem Protein für Zellmischung mischt, sobald der Lauf abgeschlossen ist.
Nehmen Sie die Zellproteinplatte aus dem Instrument und legen Sie sie auf Eis. Nehmen Sie den Deckel vom Gerät ab und legen Sie ihn so auf die Platte mit der Reservoirlösung, dass die Tropfen umgedreht werden. Inkubieren Sie die Platte bei 20 Grad Celsius.
Beachten Sie, dass auch andere Temperaturen zur Kristallbildung und -optimierung getestet werden können. Höhere Temperaturen induzieren die lamelläre Phase, was den Vorteil hat, dass das Protein in Schichten vor- oder organisiert wird. Es können Temperaturen zwischen vier Grad Celsius und 20 Grad Celsius gescreent werden.
Temperaturen unter vier Grad Celsius können dazu führen, dass die Lipide über längere Zeiträume am ersten, dritten Tag und danach wöchentlich ausfallen. Beurteilen Sie das Aussehen und Wachstum der Kristalle mit einem Standardlichtmikroskop. Hier sind ein Hellfeldbild und ein UV-Bild von nadelförmigen Kristallen zu sehen, die nur im Angriffszustand beobachtet wurden. Es wurde keine Fluoreszenz von den Kristallen nachgewiesen, was auf ein falsch positives Ergebnis in diesem Bild hinweist.
Ein stäbchenförmiger Kristall bildete sich, wenn Methylpropandiol als Fällungsmittel verwendet wurde. Der Kristall fluoresziert wöchentlich, was darauf hindeutet, dass es sich um einen Proteinkristall handeln könnte, aber mit Hilfe der Röntgenbeugung wurde festgestellt, dass er nicht dauerhaft ist. Hier ist ein Kristall zu sehen, der etwa vier Wochen nach dem Aufbau von Versuchen beobachtet wurde.
Die starke Fluoreszenz unter UV-Licht bestätigt, dass es sich um einen Proteinkristall handelt. Wie Sie in diesem Video gesehen haben. Sobald B-Zellen verfügbar sind, können sie direkt mit gereinigtem Protein gemischt werden, und von diesem Zeitpunkt an verläuft die Kristallisation fast genau wie bei Standard-Detergenzien-basierten Protokollen.
Ein weiterer entscheidender Vorteil ist die Möglichkeit, B-Zellen zu Optimierungszwecken mit spezifischen Lipiden zu dotieren. Die Technik ist wirklich sehr vielseitig und so einfach zu bedienen, dass sie für alle Projekte zur Kristallisation von Membranproteinen ausprobiert werden sollte.
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Übersicht
Dieses Video zeigt eine Methode zur Einrichtung von Hochdurchsatz-Kristallisationsversuchen von gereinigten Membranproteinen unter Verwendung von lipidischen Bizellen. Die Technik ermöglicht die Einbettung von Membranproteinen in ein Lipidmedium und erleichtert den Kristallisationsprozess.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Strukturbiologie
- Membranprotein-Kristallisation
- Biophysik
Hintergrund
- Bizellen sind Lipid/Amphiphil-Mischungen, die Membranproteine innerhalb einer Lipiddoppelschicht stabilisieren.
- Diese Technik hat ein einzigartiges Phasenverhalten, das für Hochdurchsatz-Screening vorteilhaft ist.
- Sie hat erfolgreich hochauflösende Strukturen aus verschiedenen Quellen produziert.
- Standard Laborgeräte können für Kristallisationsversuche genutzt werden.
Zweck der Studie
- Die Herstellung von Bizellen für die Kristallisation von Membranproteinen zu demonstrieren.
- Zu zeigen, wie Membranproteine in die Bizellenmischung eingebracht werden können.
- Den Prozess der Einrichtung von Kristallisationsversuchen zu umreißen.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Bizellen durch Mischen von Lipid und Detergens.
- Einbringung gereinigter Membranproteine in die Bizellenmischung.
- Kristallisationsversuche mit einem Nanoliter-Roboter durchgeführt.
- Visuelle Inspektion der Kristalle mit einem Standardlichtmikroskop.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Bildung von Proteinkristallen aus der Bizellenmischung.
- Kristalle können extrahiert und für die Datenerfassung eingefroren werden.
- Die Technik ermöglicht die effiziente Nutzung von Standard Laborgeräten.
- Die Hochdurchsatz-Fähigkeiten verbessern den Kristallisationsprozess.
Schlussfolgerungen
- Bizellen bieten ein brauchbares Medium für die Kristallisation von Membranproteinen.
- Die Methode vereinfacht den Übergang von Proteinen von Detergens zu lipidischen Umgebungen.
- Dieser Ansatz kann zu verbesserten strukturellen Bestimmungen von Membranproteinen führen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Membrane protein crystallization remains a bottleneck in structure-based drug discovery due to protein hydrophobicity and instability in detergent micelles. The lipidic bicelle method provides a more native-like lipid environment that improves protein stability and crystal quality, enabling reliable structural data for target validation. This approach supports early-stage mechanistic de-risking by facilitating high-resolution insights into drug-binding pockets and conformational states.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables structural determination of membrane proteins in a lipidic milieu that better preserves native conformation and ligand-binding sites.
- Operational Value: Reduces reliance on extensive detergent screening by providing a standardized lipidic matrix for crystallization trials.
- Predictive Value: High-quality crystals support accurate modeling of protein-ligand interactions, improving confidence in target engagement hypotheses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces diffraction-quality crystals that enable atomic-level resolution for structure-guided drug design.
- Operational Value: Compatible with standard nanoliter liquid-handling robotics, allowing integration into existing high-throughput crystallization pipelines.
- Scalability: Low viscosity of bicelle-protein mixtures facilitates automated dispensing and reduces technical barriers to automation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Structures obtained via bicelle crystallization inform the design of selective inhibitors with improved pharmacokinetic profiles.
- Mechanistic De-risking: Enables visualization of conformational states relevant to allosteric modulation and gating mechanisms.
- Preclinical Model Relevance: Supports structure-based optimization of leads targeting disease-associated membrane proteins from diverse organisms.
Pipeline & Workflow Integration
The bicelle method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing structural data that informs medicinal chemistry and preclinical candidate selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling visualization of membrane protein architecture and ligand-binding sites in a near-native lipid environment.
- Screening: Generates crystallization conditions compatible with robotic screening, increasing throughput and condition coverage.
- Analytics: Yields X-ray diffraction data that provides electron density maps for accurate model building and ligand pose validation.
- Translational Research: Connects atomic structures to functional assays, enabling correlation of binding affinity with structural perturbations.
- Enterprise Reuse: Bicelle formulations can be standardized and stored for repeated use across multiple membrane protein targets, reducing reagent variability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves success rate of membrane protein crystallization by mimicking the lipid bilayer environment.
- Operational Value: Uses standard laboratory equipment and robotics, eliminating need for specialized high-viscosity handling tools.
- Strategic Value: Accelerates lead identification by reducing time-to-structure for challenging membrane protein targets.
- Portfolio Impact: Enables data-driven go/no-go decisions based on high-confidence structural insights into target druggability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid handling and membrane protein biochemistry to optimize lipid:detergent ratios and protein incorporation.
- Depends on access to crystallization robotics and controlled-temperature incubation systems for trial setup and monitoring.
- Necessitates standardization of bicelle preparation protocols across teams to ensure reproducibility of crystallization outcomes.
- Involves optimization of lipid composition (e.g., DMPC:CHAPSO ratios) and precipitant screening to match protein-specific crystallization needs.
- Limited by the need for cold handling during preparation to maintain bicelle fluidity and prevent premature phase transitions.
