Quantitativen Vergleich der Cis-Regulatory Element (CRE) Aktivitäten in transgenen Drosophila melanogaster</em

Zusammenfassung

Phänotypische Variation für Züge können durch Mutationen in cis-regulatorisches Element (CRE)-Sequenzen, die Kontrolle Genexpressionsmuster führen. Methoden für den Einsatz in Drosophila melanogaster abgeleitet werden können quantitativ vergleichen Sie die Ebenen der räumlichen und zeitlichen Muster der Genexpression durch modifizierte oder natürlich vorkommende Varianten CRE vermittelt.

Zusammenfassung

Genexpressionsmuster von cis-regulatorisches Element (CRE)-Sequenzen, die auch als Enhancer oder cis-regulatorischen Modulen angegeben. Ein typisches CRE besitzt eine Anordnung von Bindungsstellen für verschiedene Transkriptionsfaktoren Proteine, die eine regulatorische Logik angeben, wann, wo und auf welcher Ebene die regulierten Gens (s) zum Ausdruck zu verleihen. Der vollständige Satz von Cres in ein Tier Genom kodiert des Organismus Programm für die Entwicklung ¹ und empirische als auch theoretische Studien zeigen, dass Mutationen in Cres eine herausragende Rolle spielte in morphologische Evolution ^2-4. Darüber hinaus deuten die menschliche genomweiten Assoziationsstudien, dass die genetische Variation in CREs tragen wesentlich zur phänotypischen Variation ^5,6. So Verständnis regulatorischen Logik und wie Mutationen betreffen solche Logik ist ein zentrales Ziel der Genetik.

Reporter Transgene bieten eine leistungsfähige Methode, um die in vivo Funktion StudieTION Cres. Hier ist ein bekannter oder vermuteter CRE-Sequenz ist zu heterologen Promotor und kodierenden Sequenzen für ein Reporter-Gen kodiert ein leicht beobachtbaren Protein-Produkt gekoppelt. Als ein Reporter-Transgen in einen Wirtsorganismus eingesetzt ist, wird die CRE die Aktivität sichtbar in Form der kodierten Reporter-Protein. P-Element vermittelte Transgenese in der Fruchtfliege Drosophila Arten (D.) melanogaster ⁷ hat seit Jahrzehnten verwendet werden, um Reporter Transgene in diesem Modell Organismus einbringen, obwohl die genomische Anordnung der Transgene ist zufällig. Daher ist Reportergen-Aktivität stark von der lokalen Chromatinstruktur und Gen-Umwelt beeinflusst, die Begrenzung CRE Vergleiche werden qualitative. In den letzten Jahren wurde die phiC31 basierte Integration System für den Einsatz in D. melanogaster angepasst Transgene in spezifischen Genom Landeplätze ^8-10 einfügen. Diese Fähigkeit hat die quantitative Messung der Gen hergestellt und hier relevant, CRE-Aktivität ^11-13 feasible. Die Herstellung von transgenen Fruchtfliegen ausgelagert werden können, einschließlich phiC31-basierte Integration, wodurch die Notwendigkeit für teure Ausrüstung zu kaufen und / oder Kenntnisse in spezialisierten Transgen Injektion Protokolle.

Hier präsentieren wir ein allgemeines Protokoll zur quantitativen Auswertung eines CRE Tätigkeit und zeigen, wie dieser Ansatz verwendet werden, um die Auswirkungen einer Einführung Mutation auf einem CRE Tätigkeit zu messen und die Aktivitäten der orthologen CREs vergleichen. Obwohl die Beispiele für eine CRE aktiv sind während der Fruchtfliege Metamorphose, kann der Ansatz auf andere Entwicklungsstadien, Fruchtfliege Arten oder Modell-Organismen angewandt werden. Letztlich sollte eine breitere Anwendung dieser Methode zu untersuchen CREs Voraus ein Verständnis der regulatorischen Logik und wie Logik kann variieren und sich entwickeln.

Protokoll

Übersicht:

Dieses Video zeigt ein Protokoll der Lage, quantitative Messung der Gen-regulatorischen Aktivitäten für cis-regulatorisches Element (CRE)-Sequenzen in Drosophila (D.) melanogaster. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die regulatorischen Aktivitäten besessen von zu vergleichen: Wildtyp und Mutante CRE Formen, natürlich vorkommende CRE Allele innerhalb einer Art oder orthologen CREs zwischen auseinander Arten gefunden.

1. Site-spezifische Integration von Reporter Transgene in der Drosophila melanogaster Genom

A. Reporter-Transgen Bau

1. In einem ....

Diskussion

cis-regulatorische Elemente kodieren die genomische Programm, das Genexpressionsmuster und damit den Prozess der Entwicklung ¹ gibt, und sind prominente Standorte für beide Mutationen zugrunde liegende morphologische Evolution ^2-4 und phänotypischen Variation für menschliche Züge ^5,6,19. Trotz dieser großen Bedeutung sind die regulatorischen Logik für CREs wenig verstanden. Ein prominentes Grund dafür Verständnis Defizit ist der Mangel an geeigneten Methoden, um quantitativ zu v.......