Wir beschreiben eine relativ einfache Methode der transretinal Elektroretinogramm (ERG) Aufnahmen für den Erhalt von Stäbchen und Zapfen Photomorphosen aus intakten Maus Netzhaut. Dieser Ansatz nutzt die Block der synaptischen Übertragung von Photorezeptoren ihre Lichtantworten isolieren und speichert sie über das Feld über den Elektroden isoliert flachen montiert Netzhaut zu liegen.
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Methodenartikel
Transretinal ERG Recordings aus Maus-Retina: Stäbchen und Zapfen Photomorphosen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Es gibt zwei unterschiedliche Klassen von bildgebenden Photorezeptoren in der Retina von Wirbeltieren: Stäbchen und Zapfen. Stäbchen sind in der Lage, einzelne Photonen des Lichts erkennen, während Kegel kontinuierlich arbeiten unter rasch wechselnden hellen Lichtverhältnissen. Die Absorption von Licht durch Stab-und Kegel-spezifischen visuellen Pigmente in den äußeren Segmenten der Photorezeptoren löst eine Phototransduktionskaskade, die sich letztendlich in der Schließung des zyklisch Nukleotid-gesteuerten Kanäle auf der Plasmamembran und Zelle Hyperpolarisation. Dieses Licht-induzierte Veränderung der Membran aktuellen und potenziellen kann als Photoresponse registriert werden, entweder durch klassische Saugelektrode Aufnahmetechnik 1,2 oder durch Aufnahmen transretinal Elektroretinogramm (ERG) von isolierten Netzhaut mit pharmakologisch blockiert postsynaptische Antwort Komponenten 3-5. Das letztere Verfahren kann Arzneimittel-zugänglich dauerhafte Aufzeichnungen aus der Maus Photorezeptoren und ist besonders nützlich für die Herstellung von stabilen Photomorphosen from die knappen und fragilen Maus Kegel. Im Falle von Kegeln kann solche Experimente sowohl in dunkeladaptierten folgenden Bedingungen und intensive Beleuchtung, die im wesentlichen alle bleicht Sehpigment durchgeführt werden, um den Prozess der Membran Photoempfindlichkeit Rückgewinnung beim Dunkeladaptation 6,7 überwachen. In diesem Video zeigen wir, wie Stab-und M / L-Kegel-driven transretinal Aufnahmen aus dunkeladaptierten Maus Netzhaut führen. Rod Aufnahmen durchgeführt werden, indem Retina von Wildtyp (C57Bl / 6) Mäusen. Mäuse, die Stange fehlt Signalisierung 8. Der Einfachheit halber wird Kegels Aufnahmen aus genetisch modifizierten Stabsatzes Transducin α-Untereinheit-Knockout (- / - Tα) erhalten werden
Protokoll
1. Herstellung von Elektroden
- Bereiten Glaselektroden. Wiegen Sie 120 mg Agar und mischen Sie es in 10 ml destilliertem Wasser (letzte Konzentration Agar 1,2%). Schmelzen Sie die Agar-Lösung im heißen Wasserbad. Füllen Sie Glaskapillaren (wir benutzen Word-Presision Instruments TW100-4 Kapillaren mit folgenden Abmessungen: Länge = 100 mm, Da / Di = 1/0.75 mm und innere Volumen = 44 mL) mit dem Agar-Lösung mit Kunststoff-Spritze. Verfestigen des Agar bei Raumtemperatur für 10 min. Somit können bis zu ca. 200 Kapillaren gefüllt (der Rest der Mischung kann Agar bei -4 ° C und wieder verwendet mehrfach gespeichert werden).
- Schneiden Sie die Kapillare....
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Diskussion
Die Methode der Stab-und Kegel-driven transretinal ERG Aufnahmen oben beschrieben wird immer ein mächtiges Werkzeug zur Untersuchung der Funktion der Maus Photorezeptoren sowohl in Wildtyp-und genetisch veränderte Tiere. Zusätzlich zu dem einfachen Charakterisierung von basischen Photoantwort Eigenschaften bietet diese einfache Technik große Resonanz Stabilität bei langen Experimente schließen zu erhalten Retina-Präparaten durchgeführt. Sowohl dunkeladaptierten Stange maximale Reaktion Amplitude und Lichtempfindlichkeit.......
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Offenlegungen
Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Unterstützt von Career Development Award von der Forschung zur Erblindung zu verhindern, NIH Zuschüsse EY19312 und EY19543 (VJK), sowie durch nicht zweckgebundenen Zuschuss von Forschung zur Erblindung und EY02687 (Klinik für Augenheilkunde und Visual Sciences an der Washington University) zu verhindern.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare | |
|---|---|---|---|---|
| Material Name | Typ | Firma | Katalog-Nummer | Kommentar |
| DL-A-4 | Tocris Bioscience | 0101 | ||
| Alle anderen Reagenzien | Sigma-Aldrich | |||
| Glaskapillaren | World Precision Instruments | TW100-4 | Zur Herstellung von Elektroden | |
| Filterpapier | HArg | Millipore | HABG01300 | |
| Photometer | UDT Instruments | S350 | Für leichte Kalibrierung | |
| Radiometrische Silicon Sensor | UDT Instruments | 221 | Für leichte Kalibrierung | |
| Antischwingungstisches | Technische Manufacturing Corporation | TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 | Um mechanische Geräusche zu minimieren | |
| Luftkompressor Panther P 15TC | Werther International | P 15TC | An Antischwingungstisches | |
| Stereomikroskop | LEICA | MZ9.5 | Für Maus Auge Dissektion | |
| Infrarot-Bildwandler | BEMeyers | ProwlerTM | Gebunden an Stereomikroskop | |
| Differenzverstärker DP-311 | Warner Instruments | DP-311 | ||
| Axon 1440A Digidata Digitizer | ; | Molecular Devices | 1440A | |
| Dual Channel 8-Pol-Filter | Krohn-HITE GmbH | 3382 | ||
| Keramische Widerstand | TE Connectivity | CGS SBCHE618RJ | Für Wiedererhitzen des Perfusionslösung | |
| Thermoelement | T | Physitemp Instruments | IT-18 | |
| Temperaturwächter | Omega | DPi32 | Verbunden mit Thermoelement | |
| LED 505 nm | TT Electronics / Optek Technology | Digi-Key P / N 365-1185-ND | Zum Test Blitze / Bleichen Licht gelten | |
| Kautergriff Stift | Bovie | AA25 | Zur Markierung der dorsalen Teilder Maus Augapfels | |
| pCLAMP 10 Elektrophysiologie Datenerfassung und-analyse-Software | Molecular Devices |
Referenzen
- Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments. Nature. 269, 78-80 (1977).
- Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. Physiological features of the S- an....
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Nachdrucke und Genehmigungen
