Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Summary

Die Spalthefe, Schizosaccharomyces pombe Ist ein gutes Modellsystem zur grundlegenden zellulären Prozesse zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Methode zur quantitativen Analyse der lebenden Zelle Spalthefe durchzuführen. In diesem speziellen Experiment, das wir über die Organisation des Genoms im Zellkern zu konzentrieren, aber die Methode kann auch verwendet werden, um cytosolische Faktoren zu studieren.

Abstract

Mehrere Mikroskopie-Techniken sind heute verfügbar, die ein bestimmtes Protein in der Zelle erkennen können. Während des letzten Jahrzehnts Live Cell Imaging mit Fluorochromen wie Green Fluorescent Protein (GFP) direkt an das Protein von Interesse verbunden ist zunehmend populärer geworden ^1. Mit GFP und ähnlichen Fluoreszenzfarbstoffen die subzelluläre Lokalisationen und Bewegungen von Proteinen in einem Fluoreszenz-Mikroskop erkannt werden. Darüber hinaus ist auch die subnukleare Lokalisierung einer bestimmten Region eines Chromosoms kann studierte mit Hilfe dieser Technik werden. GFP ist es, die Lac Repressor Protein (lacR) fusioniert und ektopisch in die Zelle, in Tandem-Wiederholungen der lacO Sequenz in der Region von Interesse auf der Chromosom ² eingefügt wurde zum Ausdruck gebracht. Die lacR-GFP wird die lacO wiederholt und diesem Bereich des Genoms sichtbar sein, wie ein grüner Punkt in der Fluoreszenz-Mikroskop wird zu binden. Hefe ist speziell für diese Art der Manipulation, da homologe geeignetRekombination ist sehr effizient und ermöglicht dadurch die gezielte Integration der lacO wiederholt und entwickelt Fusionsproteine ​​mit GFP ^3. Hier beschreiben wir eine quantitative Methode für Live-Cell-Analyse Spalthefe. Weitere Protokolle für Live Cell Analyse Spalthefe gefunden werden kann, zum Beispiel, wie man einen Film der meiotischen Chromosomen Verhalten ^{4 vorzunehmen.} In diesem speziellen Experiment, das wir auf subnuclear Organisation und wie ist es bei Geninduktion betroffen konzentrieren. Wir haben ein Gen-Cluster namens Chr1, durch die Einführung von lacO Bindungsstellen in der Nähe der Gene bezeichnet. Das Gen-Cluster ist für Gene, die früh während Stickstoff Aushungern von Spalthefe ⁵ induzierte bereichert. In der Belastung der Kernmembran (NM) ist durch das Anbringen von mCherry der NM-Protein Cut11 was zu einer roten Fluoreszenz-Signal bezeichnet. Die Spindel Pole Körper (SPB)-Verbindung Sid4 ist Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) ⁶ fusioniert 7 eingebettet ist beigefügt. Die SPB ist wie eine große, runde Struktur in der NM identifiziert. Durch die Abbildung vor und 20 Minuten nach dem Abbau der Stickstoff-Quelle können wir bestimmen den Abstand zwischen der Gen-Cluster (GFP) und der NM / SPB. Der Mittelwert oder Median Abstände vor und nach der Stickstoff-Abbau verglichen, und wir können somit quantifizieren, ob oder nicht es gibt eine Verschiebung in der subzellulären Lokalisation der Gen-Cluster nach dem Stickstoff Erschöpfung.

Protocol

1. Fission Hefekultur

1. Bereiten Edinburgh Minimal Medien (EMM) und EMM ohne Ammoniumchlorid (EMM-N) ^8. Zur Reduzierung der Autofluoreszenz der Glucose-Lösung sollte nicht autoklaviert werden, aber statt steril filtriert mit einem 0,2 um Filter und anschließend auf die autoklaviert Medien aufgenommen.
2. Impfen Spalthefe Zellen frisch auf einer Agar-Platte mit Rich-Media gewachsen, YEA ^8, in 3 ml EMM flüssigen Medien mit Filter sterilisiert Glukose. Verwenden Sie 13ml Röhrchen mit einem leicht auf Kappe geschoben, um eine gute Belüftung der Zellen zu gewährleisten. Lassen Sie die Zellen wachsen durch Schütteln mit 225 rpm in 30 ° C. Halten Sie die wachsenden Zellen in der log-Phase (1 X ⁰⁶ bis 2 Oktober X 10 ⁷ Zellen / ml) für 2 Tage durch Zählen sie mit einem Burker Kammer gefolgt von entsprechender Verdünnung jeden Morgen und Abend.
3. Am Tag des Experiments stellen Sie sicher, Zellen in frühen Log-Phase, 5 haben X ⁰⁶ bis 1 Oktober X 10 ⁷ Zellen / ml.
4. Um verhungern ter Zellen für Stickstoff während 20 Minuten Wechsel von EMM Medien EMM-N-Medien. Dies ist durch die Ernte 3 ml der Zellen in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen in einer Tischzentrifuge bei maximal 1,5 rcf wie Zentrifugation bei einer höheren Geschwindigkeit durchgeführt veranlassen könnte eine Stress-Reaktion in Spalthefe ^9. Verwenden Sie die Doppel-Spinning-Technik, das heißt, erste Spin für 2 min, dann drehen Sie den Eppendorf-Röhrchen 180 ° und Spin wieder für 1,5 rcf 2 min ^10. Dies hilft, um alle Zellen in einem Pellet sammeln sich am Boden des Röhrchens. Wash einmal mit EMM-N und dann lösen sich die Pellets in EMM-N und inkubieren Sie die Zellen für 15 Minuten bei 30 ° C unter Schütteln bei 225 rpm und dann weiter zu Punkt 2. Probenvorbereitung.

2. Probenvorbereitung

1. Ernte von 1,5 ml der Zellen in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen in einer Tischzentrifuge bei maximal 1,5 rcf wie Zentrifugation mit einer schnelleren Geschwindigkeit veranlassen könnte eine Stress-Reaktion in Spalthefe ^9. Verwenden Sie die Doppel-Spinning-Technik, meaning; erste Spin für 2 min, dann drehen Sie den Eppendorf-Röhrchen 180 ° und Spin wieder für 1,5 rcf für 2 min ^10. Dies hilft, um alle Zellen in einem Pellet sammeln sich am Boden des Röhrchens.
2. Entfernen Sie den Überstand, aber lassen Sie 10-15 ul und Zellen in den übrigen Medien. Alternativ gibt man 10 ml frisches Medium, um das Zellpellet resuspendieren.
3. Achten Sie darauf, Klarglas Dias haben und Deckglas (No 1,5). Normalerweise müssen Sie nicht um sie zu reinigen, aber stellen Sie sicher, sie sind nicht voller Staub.
4. Nehmen Sie aus der Tiefkühltruhe ein Aliquot einer Stammlösung von 1mg/ml Lektin, die Filter sterilisiert. Das Lektin-Lösung kann wieder eingefroren werden ein paar mal. Das Lektin wird verwendet, um die Hefezellen auf dem Deckglas fixieren.
5. Platz 5 ul der EMM mit Filter sterilisiert Glucose auf die objektive Glas.
6. Platz 5 ul des Lektin-Lösung in die Ecke des Deckglases. Anschließend Platz 5 ul der Zellkultur in der gleichen Ecke, also in das Lektin drop. Mix durch Pipettieren ein paar Mal und breitete sich dann die Zellkultur-Lektin-Mix über das Deckglas mit der langen Seite der Pipettenspitze. Abhängig von der Dichte der Zelle Mischung lassen Sie alles oder saugen überschüssige Flüssigkeit in die gegenüberliegende Ecke des Deckglases.
7. Legen Sie die Abdeckung aus Glas, oben auf, mit einer Seite auf das Ziel aus Glas und auf der anderen Seite auf der Bank. Lassen Sie das Deckglas trocken ein wenig für ein paar Minuten. Es sollte auf keinen Fall vollständig trocken sein, aber es sollte nicht zu viel Flüssigkeit auf dem Glas.
8. Legen Sie die Abdeckung aus Glas mit einem ungefähren 70 ° Engel von der objektiven Glas durch den Rückgang der EMM. Lassen Sie das Deckglas, so dass es Herbst wird von oben nach unten in die Tropfen EMM.
9. Zur Abdichtung der Kanten mit Silikonfett Vorbereitung einer 2-ml-Spritze. Schneiden Sie das breite Ende einer 200 ul Spitze und befestigen es an der Spritze. Füllen Sie die Spritze mit etwa 1 ml Silikonfett. Eine feine Linie von Silizium an die Ränder des Deckglases durch vorsichtiges Eiter angewendething der Kolben der Spritze. Jetzt haben Sie ein kleines Wachstum Kammer des S. pombe Zellen.

3. Mikroskopie

1. Initialisieren der Fluoreszenz-Mikroskopie, indem Sie die Quecksilber / Xenon-Lampe, das Mikroskop und Computer. Legen Sie die Hefe Klimakammer im Fluoreszenzmikroskop. Verwenden Sie eine 63 X Objektiv oder einem 100 X-Objektiv mit NA = 1,3 oder höher. Wenn ein Öl-Objektiv verwendet wird, Öl nachfüllen.
2. Verwenden Sie das Hellfeld auf die Zellen zu finden und ein scharfes Bild.
3. Die Einstellungen für die Fluoreszenzmikroskopie sind je nach Fluorochrome verwendet, um die Hefezellen und das Mikroskop label je. Wir verwenden einen konfokalen Mikroskop Zeiss LSM 700 Laser Scanning Mikroskop mit Plan-Apochromat 63x Öl Objektiv (NA = 1,4) mit der 16-Linie mittlere Ebene Scan-Einstellung. Die Lochkamera sollte 1-1,1 Airy-Einheiten, die eine optische Scheibe von 0,8 mm ergibt eingestellt werden. Wir erkennen GFP in Track 1 mit dem Filter-Set für Alexa 488 mit einem Strahlteiler auf 582 nm, also detecting Wellenlängen zwischen 488 und 582 nm. In Track 2 verwenden wir ein Filter gesetzt optimal für mCherry mit einem Strahlteiler bei 578 nm, also Erkennen Wellenlängen zwischen 578 und 600 nm. Dies bedeutet, dass in Track 2 sowohl die mRFP (SPB) und NM (mCherry) erkannt werden.
4. Nehmen Sie so viele Bilder benötigt, um in der Lage sein in 60 verschiedenen Zellen für jeden Stamm zu messen. In der Regel 15 Bilder von unabhängigen Mikroskopie Felder sind genug. Es wird empfohlen, eine neue Klimakammer mit frischen Zellen hergestellt wird, wenn Ihr Mikroskopie länger als 60 Minuten.

4. Quantitative Messung der subzellulären Distanzen

1. Öffnen Sie die Bilder in den Zeiss Zen Light Edition-Programm. Mit den Messungen Werkzeug messen Sie den Abstand in um zwischen den verschiedenen Fluorochromen in allen Zellen, in denen alle Signale sind in der gleichen Bildebene. Passen Sie die Lichtstärke und Kontrast zu der Mitte des Fluoreszenzsignals zu identifizieren. Dieser vereinfachte Protokoll verwendet nur zwei verschiedene colours und damit die SPB und NM sind in den gleichen Kanal. Die SPB ist durch seine große, runde Struktur in der NM hervorgehoben. Übertragen Sie die Abstände zu einem Notizblock Blatt. Messen Sie in mindestens 60 Zellen. Andere Programme wie ImageJ könnte auch genutzt werden, um den Abstand zu messen, sondern Zeiss Zen Light ist aufgrund seiner höheren Auflösung des Bildes und der Leichtigkeit, in und mit Hilfe dieses Programms zoom bevorzugt. Bilder in lsm Format in ImageJ geöffnet haben die beiden Kanäle auf der jeweils anderen. Um ein Bild mit beiden Kanälen, erste Spaltung der beiden Kanäle und danach zusammenführen. Danach wird das Tool kann verwendet werden, um die Abstände, wie oben beschrieben gemessen werden.
2. Vergleichen Sie die Mittelwert oder Median subzellulären Abstände zwischen verschiedenen Stämmen und Behandlungen mit einem statistischen Programm, zum Beispiel t-Test oder Mann-Whitney Rank Sum Test, zum Beispiel durch Verwendung der SigmaStat-3.5-Software. Häufig werden die Daten nicht normal verteilt, da es eine Auswahl von Zellen mit kürzeren werdenAbstände zwischen den Fluoreszenz-Signale, da alle Signale müssen in der gleichen Bildebene zu messen sein. Ein T-Test kann nur verwendet werden, wenn die Daten einer Normalverteilung, während ein Mann-Whitney Rank Sum Test ermöglicht den Vergleich von Datensätzen, die Normalverteilung Mangel sein. In einem t-Test der Mittelwert von zwei unterschiedlichen Datensätzen verglichen werden, während in einem Mann-Whitney-Rangsummentest der Median verglichen wird.

5. Repräsentative Ergebnisse

Der Stamm PJ1185: (h ^{+ +} his7: dis1placR - GFP Chr1 [:: ura4 ⁺ hphMX6 lacO] sid4-mRFP: kanMX6 cut11-mCherry: natMX6 ura4-D18 leu1-32 ade6-DN / N) wurde in EMM gewachsen . Eine Probe wurde entnommen und montiert in einer kleinen Klimakammer und Bilder aufgenommen wurden (Abb. 1A + N). Anschließend wird das Nährmedium wurde mit EMM w / o Ammoniumchlorid (EMM-N) ersetzt und die Zellen wurden grown für 15 Minuten unter Schütteln. Der Stickstoff unterversorgten Zellen wurden dann in eine Klimakammer mit EMM-N und Bilder montiert wurden (Abb. 1A-N). Das Messgerät wurde verwendet, um den Abstand zwischen dem Locus (GFP) und der SPB (Abb. 1B und Tabelle 1) zu messen. Darüber hinaus wurde der Abstand zwischen den locus (GFP) und die NM gemessen (Abb. 1B und Tabelle 2). Der Median subzellulären Strecken vor und nach der Stickstoff-Abbau wurden verglichen mit dem SigmaStat-3.5-Software (Tabelle 3). Es gab eine statistisch signifikante Verschiebung in der Lokalisation der Gen-Cluster weg von der NM zur SBP. Die Daten zur Messung der Entfernung zwischen dem GFP und die SBP hatte eine normale Verteilung und damit die mittlere Entfernungen (1,777 um + N und 1.587 um-N) konnte im Vergleich mit einem t-Test (Tabelle 1 und 3). Es bestand ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Mittelwerten (P = 0,008, t-Test). Die Daten zur Messung der Entfernung zwischen dem GFP und NM nicht über eine normale distribution und damit die mittlere Entfernungen (0 um + N und 0,390 um-N) wurden mit Hilfe eines Mann-Whitney Rank Sum-Test (Tabelle 2 und 3). Es bestand ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden mittleren Werte (p <0,001, Mann-Whitney Rank Sum Test).

Abbildung 1. Die Lokalisierung eines Clusters von Genen namens Chr1 von GFP markiert, nach dem Stickstoff Hunger verändert. (A) Linke Spalte, + N, eine repräsentative Zellkern aus einer Zelle in EMM rechte Spalte gewachsen,-N, eine repräsentative Zellkern aus einer Zelle in EMM-N gewachsen. Grün ist die GFP-Signal Kennzeichnung der Chr1 Cluster ist Rot die mRFP und mCherry Kennzeichnung der SPB und nM. (B) Gleiche Zellkern als (A), aber jetzt mit gemessenen subnuclear Distanzen, gelb: der Durchmesser des Zellkerns, blau: der Abstand zwischen SPB und GFP-Signal und rosa: der Abstand zwischen den GFP-Signal und die Kernmembran.

Tabelle 1. Die gemessenen subnuclear Entfernungen in um der PJ1185 Belastung in EMM gewachsen. Erste Reihe, Durchmesser der Zelle (d), zweite Reihe, Abstand zwischen den GFP und der SPB, dritte Reihe, Abstand zwischen den GFP und die NM.

Tabelle 2. Die gemessenen subnuclear Entfernungen in um der PJ1185 Belastung in EMM-N gewachsen. Erste Reihe, Durchmesser der Zelle (d), zweite Reihe, Abstand zwischen den GFP und der SPB, dritte Reihe, Abstand zwischen den GFP und die NM.

Tabelle 3. Beschreibende Statistik der beobachteten subnuclear Strecken im Stamm PJ1185 vor (+ N) und nach (-N) Stickstoff Hunger. Erste Zeile: Anzahl der Zelle gemessen, zweite Reihe: mittlere Durchmesser (d), dritte Zeile: mittlere Durchmesser (d), weiter Reihe: mittlere Abstand zwischen den GFP und SPB, fünfte Zeile: Median Abstände zwischen den GFP-und NM.

Discussion

Während des letzten Jahrzehnts den Einsatz von Live Cell Imaging, um zelluläre Ereignisse zu überwachen ist zunehmend populärer geworden. Es begann mit dem Einsatz von grün fluoreszierendes Protein, von Qualle Aequorea victoria und jetzt viele verschiedene Fluorochrome sind Fluoreszenz-durch ein breites Spektrum von cyan (475 nm) bis weit roten (648 nm) ^11. Einer der wichtigsten Vorteile des Live Cell Imaging über Immunfluoreszenz ist, dass die Zellen nicht durch Formaldehyd oder Ethanol / Aceton-Behandlung vor der Mikroskopie fixiert, damit Vermeidung möglicher Artefakte aus der Fixierung. Darüber hinaus bietet Live Cell Imaging die Möglichkeit, einzelne Zellen zu verfolgen und zu fotografieren in kurzen Abständen während Stunden oder Tagen der Inkubation, die es ermöglicht, Filme von zellulären Ereignissen ^{12 Jahre} erhalten. Säugetierzellen haben den Vorteil, dass eine größere Größe, mit Durchmessern von etwa 100 Mikrometern, im Vergleich zu den kleineren Hefezelle mit einem Durchmesser von etwa 3-4 μ m. Auf der anderen Seite liegt der Vorteil mit der Hefe der leicht manipuliert Genoms. Die homologe Rekombination erfolgt sehr effizient in der Hefe und wird verwendet, um Proteine ​​von Interesse zu unterschiedlichen Fluorochromen ³ Sicherungen. Darüber hinaus durch gezielte Integration von lacO Sequenzen und anschließende Expression von lacR-GFP-Protein ermöglicht die Erkennung eines bestimmten Teils des Genoms im Zellkern ^2. Mit S. pombe-Zellen in der Mikroskopie hat zusätzliche Vorteile, da sie natürliche einzellige Organismen, die mit einem schnellen Generationszeit in Low-Cost-Bedingungen der Zellkultur wachsen. Darüber hinaus S. pombe ist ein ausgezeichneter eukaryotischen Modellorganismus, da es Metazoen homologe Gene hat.

Eine der wichtigsten Einschränkungen dieser Technik ist Autofluoreszenz in der Hefezelle stören den Nachweis des echten Signals. Dieses Problem kann durch die Verwendung minimal Nährmedien mit Filter sterilisiert Glukose statt autoklaviert überwunden werden. InNeben den Hefezellen sollten für 2 Tage in der log-Phase vor dem Einbau zusammen angebaut werden. Das Protokoll hier vorgestellten bietet eine relativ einfache, aber dennoch quantitative Methode, um die subzelluläre Lokalisation von Proteinen innerhalb der Hefezelle zu bestimmen. Darüber hinaus, indem sie Bilder zu verschiedenen Zeitpunkten können wir folgen zellulären Vorgänge.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenz / Ausrüstung	Firma	Katalog-Nummer	Kommentar
Lectin	Sigma	L1395
Silikonfett	Dow Corning
Laser-Scanning-Mikroskop LSM 700	Zeiss	LSM 700	Andere konfokalen Mikroskop verwendet werden könnte.
SigmaStat 3,5	Statcon	SigmaStat 3,5	Jede Software für statistische Analysen verwendet werden könnte.