Wachstums-Assays zur Beurteilung Polyglutamin Toxizität in Hefe

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt drei sich ergänzenden Protokolle zur Beurteilung der Toxizität von Polyglutamin (Polyglutamindomänen)-Expansion Proteinen in der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Diese Protokolle können einfach modifiziert, um die Toxizität von anderen fehlgefaltete Proteine ​​in Hefe zu überwachen.

Zusammenfassung

Fehlfaltung mit vielen Krankheiten, insbesondere neurodegenerativer Erkrankungen, wie Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit und Huntington-Krankheit ¹ zugeordnet ist. Huntington-Krankheit (HD) durch die anormalen Entwicklung eines Polyglutamin (Polyglutamindomänen) Bereich innerhalb des Proteins Huntingtin verursacht. Die Polyglutamindomänen-expanded Huntingtin-Protein erreicht eine anomale Konformation (dh es misfolds) und verursacht zelluläre Toxizität ^2. Mindestens acht weiteren neurodegenerativen Krankheiten werden durch Polyglutamindomänen-Erweiterungen, einschließlich der Spinozerebelläre Ataxien und Kennedy-Syndrom ³ verursacht.

Der Modellorganismus Hefe hat wesentliche Einblicke in die zellulären und molekularen Grundlagen der Polyglutamindomänen-Toxizität erleichtert, einschließlich der Auswirkungen von intra-und inter-molekularen Faktoren der Polyglutamindomänen-Toxizität und die Identifizierung von zellulären Signalwegen, die in Zellen beeinträchtigt sind Ausdruck Polyglutamindomänen-Expansion Proteine ^​​8.3. Wichtigly, wurden viele Aspekte der Polyglutamindomänen-Toxizität, die in der Hefe gefunden wurden, in anderen experimentellen Systemen und in gewissem Maße in Proben von HD-Patienten reproduziert und bewiesen damit, die Bedeutung des Hefe-Modell für die Entdeckung der grundlegenden Mechanismen zugrunde Polyglutamindomänen-Toxizität.

Eine direkte und relativ einfachen Weg, um Polyglutamindomänen-Toxizität in Hefe zu bestimmen ist, um das Wachstum von Hefe-Defekte Zellen, die Proteine ​​Polyglutamindomänen-Expansion zu messen. Dieses Manuskript beschreibt drei komplementäre experimentelle Ansätze zur Polyglutamindomänen-Toxizität in Hefe durch Messung bestimmen das Wachstum von Hefe-Zellen, die Proteine ​​Polyglutamindomänen-Expansion. Die ersten zwei experimentelle Ansätze verfolgen das Wachstum der Hefe auf Tellern, überwacht der dritte Ansatz, das Wachstum von flüssigen Hefekulturen mit dem BioscreenC Instrument.

Darüber hinaus beschreibt diese Handschrift experimentellen Schwierigkeiten, die auftreten beim Umgang mit Hefe Polyglutamindomänen Modelle können und skizziert Strategien, die helfen, oder zu vermeiden wirddiese Schwierigkeiten zu minimieren. Die Protokolle können die hier beschriebenen zu identifizieren und zu genetischen Wegen und kleinen Molekülen, die Polyglutamindomänen-Toxizität modulieren zu charakterisieren. Darüber hinaus können die beschriebenen Assays als Template für eine genaue Analyse der Toxizität von anderen Krankheit assoziierte fehlgefaltete Proteine ​​in Hefe verursacht Modelle dienen.

Protokoll

1. Expression von toxischen PolyQ-Erweiterung Proteine ​​in Hefe

Eine systematische Analyse der genauen Aminosäuresequenz eines Proteins Polyglutamindomänen-Erweiterung, die erforderlich ist, um Toxizität in Hefe ⁷ erzeugen hergestellt wird. Diese toxische Polyglutamindomänen-Expansion-Protein enthält eine Amino-terminalen FLAG-Tag durch 17 Aminosäuren von der ursprünglichen Sequenz des Huntingtin-Protein, einem Polyglutamindomänen Region und eine Carboxy-terminale Fusion mit einem fluoreszierenden Protein (GFP oder entweder GFP gefolgt, siehe Abbildung 1 a). Die Expression von Proteinen mit Polyglutamindomänen Erweiterungen von ....

Diskussion

Dieses Manuskript beschreibt drei sich ergänzende experimentelle Ansätze zu Polyglutamindomänen-Toxizität in der Modell-Organismus Hefe zu vermindertem Wachstum von Hefe-Zellen, die toxische Polyglutamindomänen-Erweiterung der Basis von Proteinen zu messen. Work in Hefe hat tiefe Einblicke in die grundlegenden zellulären und molekularen Mechanismen der Fehlfaltung und dessen entsprechend Toxizität, einschließlich der Fehlfaltung und Toxizität von Polyglutamindomänen-Erweiterung Proteine ^{​​9,11,12} angeboten. V.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Instruments	Firma	Katalog-Nummer
Frogger (6x8 Pins)	V & P Scientific, San Diego	VP 407 AH
BioscreenC	Growthcurves USA	5101370
100-Well-Wabenplatten	Growthcurves USA	9602550