Gießen und Ausführen eines Protein-Gel durch die Wiederverwendung von Gewerbe-Kassetten

Zusammenfassung

Unser Protokoll zeigt, wie mehrere Proteingele zu einer Zeit, gießen durch Recycling Invitrogen NuPAGE Novex Minigel Kassetten und kostengünstige Materialien zu einem Baumarkt gekauft. Dieses wirtschaftliche und optimierte Verfahren umfasst einen Weg, um die Gele bei 4 ° C lagern für ein paar Wochen. Durch die Wiederverwendung der Kunststoff-Gel-Kassetten aus kommerziell erhältlichen Gelen, Labors, die häufige Proteingele laufen können erhebliche Kosten sparen und die Umwelt schonen.

Zusammenfassung

Die Auswertung der Proteine ​​mit Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE-Analyse) ist eine gängige Technik der Biochemie und Molekularbiologie Forscher ^1-4 verwendet. Für Laboratorien, die täglich Analyse von Proteinen führen, können die Kosten für im Handel erhältliche Polyacrylamidgelen (~ $ 10/gel) beträchtlich sein im Laufe der Zeit. Um diese Kosten zu mindern, bereiten einige Forscher ihre eigenen Polyacrylamidgelen. Traditionelle Methoden der Ausgießen dieser Gele verwenden üblicherweise spezialisierte Ausrüstung und Glas-Gel-Platten, die teuer und schließt Gießen viele Gele und speichert sie für eine zukünftige Verwendung kann. Darüber hinaus kann der Handhabung von Glasplatten bei der Reinigung oder Gel in Gießen versehentlichem Bruch schafft ein Sicherheitsrisiko darstellen, was ihren Einsatz in Labor Undergraduate-Klassen ausschließen kann zur Folge haben. Unser Protokoll zeigt, wie mehrere Proteingele gleichzeitig gießen Recycling von Invitrogen NuPAGE Novex Minigel Kassetten, und preiswert maMaterialien gekauft zu einem Baumarkt. Dieses wirtschaftliche und optimierte Verfahren umfasst einen Weg, um die Gele bei 4 ° C lagern für ein paar Wochen. Durch die Wiederverwendung der Kunststoff-Gel-Kassetten aus kommerziell erhältlichen Gelen, Labors, die häufige Proteingele laufen können erhebliche Kosten sparen und die Umwelt schonen. Darüber hinaus sind Kunststoff Gelkassetten extrem bruchfest, was sie ideal für Bachelor-Labor Klassenzimmer macht.

Protokoll

1. Vorbereitung der Kassetten

1. Saubere Vorder-und Rückseite eines gebrauchten Platten Invitrogen NuPAGE Novex Minigel Kassette, oder andere Geschäfte Minigel Kassette.
2. Bereiten Sie etwa 1-3 ml Kunststoff Epoxy und gut mischen nach Anweisungen des Herstellers.
3. Anwenden das Epoxidharz auf die Innenkante der Frontplatte, wobei die beiden Platten in Berührung kommen wird, wenn die Kassette montiert ist.
4. Schieben ein Stück Filterpapier Papier oder Karton durch den Bodenschlitz der Rückplatte bei der Montage der Kassette, um überschüssiges Epoxidharz von Abdichten der Öffnung zu verhindern. Entfernen Sie das Filterpapier, sobald die beiden Platten zusammengebaut werden.
5. Zeigen Binder Clips an den Rändern für einen dichten Verschluss, und lassen Sie die Kassetten sitzen über Nacht für das Epoxidharz vollständig aushärten.
6. Verschließen Sie den Schlitz an der Unterseite der hinteren Platte mit Isolierband.

2. Gießen des Trenngels

1. Um einen 125-ml Seitenarm Kolben, fügen Sie die folgende:2,25 ml 4X Tris-Base Trenngelpuffer pH 8,70, 3,50 ml 30,8% Acrylamid / Bisacrylamid, 3,25 ml Typ I analysenreines Wasser (IRG-H ₂ O) mit einem Gesamtvolumen von 9 ml.
2. De-Gas die Lösung für 10 min durch Anbringen der Seitenarm des Kolbens auf einer Vakuumvorrichtung, und Platzieren eines invertierten Anschlag auf dem oberen Ende des Kolbens.
3. Übertragen Sie die 9 ml entgastem Lösung auf eine 50 ml Einweg-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen eingewogen und mit 30 ul 10% ammounium Persulfat (APS) und 6 ul N, N, N ', N',-Tetramethylethylendiamin (TEMED) und mischen auch durch Schwenken der Lösung zu vermeiden, Einführen von Bläschen.
4. Gießen Sie sofort die Lösung in der Kassette, so dass es zu laufen an der Seite der Kassette, um alle Blasenbildung zwischen den Gel-Platten zu verhindern. Füllen Sie die Kassette auf ca. 2 cm vom oberen Rand des vorderen (kürzeren) Platte.
5. Sanft fügen Sie 0,5 ml 1-Butanol mit 1X Trenngelpuffer gesättigt und lassen Sie das Gel für 1 polymerisierenStunde.

3. Gießen der Sammelgel

1. Fügen Sie das folgende in einen 125 ml Seitenarm Flasche: 0,75 ml 4X Tris-Base Stacking-Gel-Puffer pH 6,80, 0,40 ml 30,8% Acrylamid / Bisacrylamid, 1,85 ml IRG-H ₂ O mit einem Gesamtvolumen von 3 ml.
2. De-Gas die Lösung für 10 min, wie in Schritt 2 beschrieben.
3. Während die Stacking-Gel-Lösung Entgasung, giesst die 1-Butanol mit 1X Trenngelpuffer von der Oberseite des Trenngels gesättigt. Spülen Sie den oberen Rand des Trenngels einmal mit IRG-H ₂ O. Gießen Sie das Wasser ab und verwenden Sie eine saugfähige oder Whatman-Filterpapier, um restliche Flüssigkeit zu absorbieren.
4. Nehmen Sie 3 ml Ihren entgaste Lösung und fügen 9 ul von 10% APS und 2 ul TEMED und gut mischen.
5. Schnell geben die Lösung in der Kassette, so dass er mittig entlang der Seite der Kassette, bis sie nahe dem oberen Rand der kürzeren vorderen Gelplatte ist.
6. Legen Sie eine saubere Gel Kamm in der Spitze des Gelkassette,Stellen Sie einen Binder Clip auf der Kassette über den Kamm zu halten Sie es fest. Lassen Sie die Stacking-Gel für 1 Stunde bis über Nacht zu polymerisieren.

4. Speichern Sie das Gel

1. Wenn das Gel vollständig polymerisiert, entfernen Sie die Binder Clips und legen Sie die Kassette in einer heißsiegelfähigen Plastikbeutel oder eine wieder verschließbare Plastiktüte.
2. Gießen 20 ml 1X Stacking-Gel Puffer, 0,1% Natriumazid in den Beutel enthält.
3. Heißzusiegeln den Beutel für 5 Sekunden und stellen Sie sicher, es gibt keine Lecks in der Tasche.
4. Bewahren Sie das Gel bei 4 ° C

5. Die Vorbereitung der Proben

1. In einem dünnwandigen Mikrozentrifugenröhrchen, summieren sich auf 6,5 ul der Probe Protein, 7,5 ul 2x Novex Tris-Glycin-SDS-Probenpuffer, 1 ul 100 mM Dithiothreitol (DTT) und IRG-H ₂ O (falls erforderlich) für ein Gesamtvolumen von 15 ul.
2. Mischen Sie die Probe durch Vortexen, und kurz zentrifugieren Sie die Probe auf Inhalte auf dem Boden des Röhrchens zu bringen.
3. denaturieren die Probe bei 70 ° C für 10 min.

6. Das Ausführen des Gels

1. Richten Sie das Novex Gel-Apparatur.
2. Zugabe von 200 ml Tris-Glycin-Laufpuffer, die 500 ul NuPAGE Antioxidationsmittel in die innere Kammer, und 300 ml Tris-Glycin-Laufpuffer in die äußere Kammer enthält.
3. Legen Sie die denaturierten Proteinproben (15 ul) in die Vertiefungen mit einem Gelbeladung Pipettenspitze.
4. Die Elektrophorese bei 200 V für 60-70 min.

7. Färbung des Gels

1. Nehmen Sie die Kassette aus dem Gel Apparate und brechen die Epoxiddichtung durch Aufhebeln der beiden Kunststoff-Gel-Platten auseinander mit einem Messer oder einem Gel steif Spachtel. Trennen Sie vorsichtig das Gel von den Platten, darauf achtend, nicht reißen das Gel.
2. Spülen des Gels mit IRG-H ₂ O dreimal mit leichtem Schütteln.
3. Färben des Gels mit Invitrogen SimplyBlue SafeStain für 1 Stunde unter leichtem Rühren.
4. Abgießen und FärbelösungEntfärben des Gels mit IRG-H ₂ O.

8. Die Reinigung der Kassetten

1. Verwenden Sie einen Spachtel aus Metall zu kratzen oder ablösen all dem Epoxidharz auf den Kassetten, so dass sie wieder verwendet werden können.
2. Waschen Sie jede der Kunststoff-Gel-Platten mit einer milden Reinigungslösung, und spülen Sie gut mit Leitungswasser mit destilliertem Wasser spülen.

9. Repräsentative Ergebnisse

Da Epoxy eine wasserdichte Abdichtung (1) bilden wird, werden die Kassetten nicht lecken, wenn das Acrylamid-Lösung in sie gegossen wird. Darüber hinaus können die Gelkassetten leicht geöffnet werden, um das Gel für die Färbung abzurufen, und das Epoxidharz kann aus der Kassetten abgezogen werden, um ihre weitere Wiederverwendung zu ermöglichen. Wie in 2 gezeigt ist, zeigt das Gel klare Trennung von Protein-Marker und Probe Bands für den routinemäßigen-Elektrophorese.

Abbildung 1. AppliKationen von Epoxy zu Minigel Kassetten abzudichten. Eine dünne Schicht von Epoxid wird an den Rand einer der Kassetten vor der Montage aufgebracht. Um das Epoxid zu markieren, war es falsch-rot gefärbt in diesem Bild.

Abbildung 2. Trennung von Proteinen auf einem SDS-Tris-Glycin-Gel gegossen und mit wieder verwendet Minigel Kassetten. SDS-PAGE durchgeführt wurde, wie oben beschrieben. Nach der Elektrophorese wurde das Gel aus der Minigel Kassette, in SimplyBlue SafeStain gemäß den Anweisungen des Herstellers gefärbt entfernt und fotografiert mit weißem Licht übertragen. Spur M enthält SeeBlue Plus2 Pre-gefärbten Protein-Standards. Die Molekulargewichte der Proteine ​​in Spur M sind auf der rechten Seite des Gels in Kilodalton (kDa) angegeben. Die anderen Spuren für Proteine ​​aus einem geklärten Lysat von Bakterien Expression eines Glutathion-S-Transferase (GST)-markierte Protein. Die Proteine ​​sind diejenigen vom g gewaschenlutathione Kügelchen vor der Elution des GST-markierten Proteins.

Diskussion

Protein-Gel-Elektrophorese ist eine unverzichtbare Methode für die meisten molekularbiologischen Laboratorien. Im Handel erhältliche Minigelen bieten ein hohes Maß an Komfort, sondern kann teuer werden. Hier zeigen wir, wie man die Wiederverwendung der Minigel Kassetten aus einer populären Marke im Handel erhältliche Minigelen. Dieses Verfahren hält die Einfachheit eines vorgefertigten Quelle von Gelen, aber nur einen Bruchteil der Kosten für im Handel erhältliche Minigelen. Ein wichtiger Schritt in diesem Verfahren wir...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenz	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Invitrogen NuPAGE Novex Minigel Cassette (1,0 mm)	Invitrogen	NC2010	Erhältlich in 2, 5, 10, 12, 15 und 2D-Brunnen
Kunststoff Epoxy	Loctite	108771
Electrical Tape	Scotch
125 ml Seitenarm Kolben	Pyrex	5360
4X Tris-Base Trenngelpuffer			1,5 M Tris-Base pH 8,7
Acrylamid	Fisher Scientific	01065-500
Bis-Acrylamid	MP Biomedicals, Inc.	800173
30,8% Acrylamid-Lösung			30:0.8 Acrylamid: Bisacrylamid in IRG-H 2 O
10% igen APS	Fisher Scientific	BP179-25	0,1 g Ammoniumpersulfat in 1 ml IRG-H 2 O, unmittelbar vor der Verwendung hergestellt
TEMED	Arcos Organics	138450500
1-Butanol mit 1X Trenngelpuffer gesättigt			5.02 1-Butanol auf 1X Trenngelpuffer
4X Tris-Base Stacking-Gel-Puffer			1,5 M Tris-Base pH 6,8
Gel Kamm	Invitrogen	NC3015	15 gut, 1,0 mm Stärke
Impulssiegelgerät	TEW Elektroheizausruestung
Heisssiegelfähige Pouch	Kapak / Scotchpak		1 Pint Größe (6,5 "x 8")
Gel-Speicherpuffer			1X Sammelgel-Puffer mit 0,1% Natriumazid
Novex Tris-Glycin-SDS-Probenpuffer (2X)	Invitrogen	LC2676
DTT	FisherBiotech	BP172-5
10X Tris-Gylcine Laufpuffer	Invitrogen	LC2675	1L von 10X Lager: 29,0 g Tris-Base, 144,0 g Glycin, 10,0 g SDS
XCell SureLock Mini-Cell	Invitrogen	EI0001
Gel Knife	Invitrogen	EI9010
SimplyBlue Sichere Stain	Invitrogen	LC6065