Summary
우리는 FDA 승인, superparamagnetic 철 산화물 (SPIO), ferumoxytol (Feraheme)와 줄기 세포를 라벨링 및 추적을위한 기술을 설명합니다. 시각화에 대한 자기 공명 (MR) 영상을 이용하여이 세포 이미징 기술은 환자의 성공 여부에 줄기 세포 engraftments의 장기 모니터링 및 진단을 위해 쉽게 액세스할 수 있습니다.
Abstract
줄기 세포 기반 요법은 재생 의료 분야에 대한 상당한 잠재력을 제공합니다. 그러나, 많은 이식 세포의 생체내 반응 속도론에 관한 이해에 남아 있습니다. 반복 생체내에 이식 줄기 세포를 모니터하는 비침습 방법은 수사관이 직접 줄기 세포 이식을 모니터링하도록하고 성공 여부 engraftment 결과를 확인합니다.
줄기 세포의 다양한 수많은 어플 리케이션을위한 조사하고 있습니다. 인간의 배아 신장 293 (HEK293) 세포, 인간 mesenchymal 줄기 세포 (hMSC)과 유도 pluripotent 줄기 (IPS) 세포 :이 프로토콜은 3 개의 줄기 세포 집단에 초점을 맞추고 있습니다. HEK 293 세포는 가지각색으로 아데노 바이러스 5 DNA와 문화 속에서 자란 인간의 배아 신장 세포에서 파생됩니다. 그들이 쉽게 양식 때문에 이러한 세포가 광범위하게 연구에 사용되고, 빠르게 성장하고 쉽게 transfected 수 있습니다. hMSCs는 성인 골수에서 발견됩니다. 이러한 세포 CAmultipotency 또는 세포 운명의 제한된 수의으로 차별화할 가능성을 유지하면서 N은 undifferentiated 세포로 복제됩니다. hMSCs는 osteoblasts, adipocytes, chondrocytes, 힘줄, 근육 및 골수의 기질을 포함 mesenchymal 조직의 lineages로 구별하실 수 있습니다. IPS 세포는 유전자 유전자와 배아 줄기 세포의 정의 속성과 비슷한 요소를 표현하기 위해 수정되었습니다 성인 세포를 다시 프로그램입니다. 이러한 세포들은 모든 세포 lineages 1로 차별화하는 능력을 가지고 pluripotent 의미입니다. 모두 hMSCs와 IPS 세포는 조직 재생 능력 - 생체내를 증명하고있다.
함께 superparamagnetic 철 산화물 (SPIO) nanoparticle 셀 라벨의 사용과 자기 공명 (MR) 영상은 가까운 미세한 해부 해상도에 의한 줄기 세포의 생체내 추적에 효과 입증, 그 이상 혈액 반감기는 세로 이미징과를 허용 높은 sensitivitSPIO의 MR 이미징에서 제공하는 세포 감지 y는 2-4 nanoparticles. 또한, SPIOs의 사용과 MR 영상은 임상적으로 번역입니다. SPIOs는 플라즈마 구성 요소에서 bioreactive 철 코어를 포함하는 역할을 dextran, carboxydextran 또는 전분 표면 코팅과 철 산화물 코어로 구성되어 있습니다. 이러한 에이전트는 T2 - 가중 MR 이미지 5 감소 신호로 이어질 현지 자기장 inhomogeneities을 만듭니다. 불행하게도, SPIOs은 더 이상 생산되고 있지 않습니다. 2 세대, ultrasmall SPIOs (USPIO)는, 그러나, 대안을 제공합니다. Ferumoxytol (FerahemeTM)는 polyglucose sorbitol carboxymethylether의 코트로 둘러싸여 아닌 stoichiometric 자철광 코어로 구성된 하나 USPIO입니다. ferumoxytol의 콜로이드, 입자 크기는 빛의 산란에 의해 결정 17-30 NM됩니다. 분자량은 750 kDa이며, 2T MRI 분야에서 상수 relaxivity은 58.609 MM - 1 - 1 초 강도 4. Ferumoxytol은 최근 FDA 승인되었습니다신장 장애 환자 6 철분 결핍증의 치료에 S는 철 보충. 우리 그룹은 셀 라벨 응용 프로그램을위한 '오프 라벨'사용이 에이전트를 적용했습니다. 우리의 기술은 MR 이미지에 라벨 세포의 중요한 MR 신호 효과를 리드 ferumoxytol와 줄기 세포의 효율적인 라벨을 보여줍니다. 이 기술은 사전 임상 및 임상 설정에서 줄기 세포 요법의 비침습 모니터링 적용될 수 있습니다.
Protocol
1. 1 일
1) 플레이트 세포
- 적어도 18-24시간 전에 라벨에 confluency 80 %에서 T75 플라스크에 플레이트 hMSC. 다른 선박에 대한지도를 위해 표 1을 참조하십시오.
2. 날 2
2) 라벨 솔루션을 준비합니다. 이 준비 400 μg 철 / ML의 농도와 confluency 80 % (1) T75 플라스크 레이블을 것입니다. 다른 선박에 대한지도를 위해 표 1을 참조하십시오.
- 15 ML 원뿔 튜브 : 혈청이없는 미디어 1 ML과 ferumoxytol의 93.1 μl (30 MG / ML 주식)를 혼합하여 솔루션 (해결책 1) 만듭니다.
- 두 번째 15 ML 원뿔 튜브 : 혈청 무료 매체와 프로타민 황산 7 μl (10 MG / ML 재고 없음) 1 ML을 혼합하여 두 번째 솔루션 (해결책 2) 만듭니다.
- 각 솔루션은 5 분 휴식을 허용합니다.
- 함께 해결책 1과 2를 추가합니다. 부드럽게 새로운 라벨 솔루션을 섞는다. 5 분 휴식하는 솔루션 USPIO - PRO을 허용하도록 허용tamine 황산의 단지가 형성.
- SPIO / 7 ML의 최종 볼륨 프로타민 황산 용액의 혼합이 ML에 혈청이없는 미디어의 5 ML을 추가합니다.
3) 라벨에 대한 전지를 준비
- 세포에서 미디어를 기음.
- 천천히 거리에 대비 에이전트 이해와 라벨 효율에 악영향을 수 잔류 혈청 단백질 및 기타 미디어 구성 요소를 씻어 사전 예열 MG / CA - 무료로 D - PBS 또는 혈청 프리 미디어로부터 2-3 ML로 한번 세포를 씻는다. 린스 액을 기음.
4) 레이블 셀
- 세포로 해결책을 라벨의 전체 7 ML을 추가합니다.
- 인큐베이터 (37 ° C / 5퍼센트 CO 2)와 세포를 4 시간 동안 상표 솔루션에 품어 수 있도록 장소에 세포.
- 10 % 최종 혈청 농도를 달성하기 위해 세포의 라벨 솔루션으로 FCS 700 μl를 추가합니다. 혈청은 세포가 익숙한 어떤의 풍부한 환경을 다시 설정하고, MI에 도움에 추가됩니다돌연 변화의 혈청이없는 환경에 24 시간 노출 초래할 수 세포 죽음을 nimizing.
- 세포가 추가로 20 시간 라벨 솔루션으로 품어 수 있습니다.
3. 3 일
5) 표시 전지를 준비
- 세포의 라벨 솔루션을 기음.
- 부드럽게 미리 예열 MG / CA - 무료로 D - PBS로부터 2-3 ML로 세포를 씻어. PBS를 기음. 그것은 MG와 CA는 다음 단계에서 트립신의 효율성에 악영향을 줄 것이다대로 MG / CA - 무료로 PBS를 사용하는 것이 중요합니다.
- 세포에 미리 예열 0.05 %의 트립신 2 ML을 추가하고 술병의 전체 표면을 보장하기 위해 앞뒤로 술병을 기울이 트립신의 얇은 층으로 덮여있다. 인큐베이터 (37 ° C / 5퍼센트 CO 2)의 세포를 놓고 세포가 접시에서 분리 시작 때까지 세포 5~7분 또는 휴식을하실 수 있습니다. 그것은 현미경으로 부대를 확인 할 수 있습니다. 부드럽게 필요한 경우 FA로 술병의 측면을 탭세포 표면 부대를 cilitate.
- 트립신을 중화하기 위해 술병에 사전 예열 전체 미디어의 4 ML을 추가합니다. 부드럽게 여러 번 트립신 / 미디어 / 셀을 솔루션을 pipetting 아래로 술병을 씻어. 15 ML 원뿔 튜브에 전체 솔루션을 수집합니다. 5 분 400 RCF의 셀 솔루션을 원심 분리기.
- 세포 펠렛을 방해하지 않고 뜨는를 주의깊게 기음. 미디어 5 ML (혈청 포함하거나 혈청 무료)에있는 세포를 Resuspend. 5 분 400 RCF의 셀 솔루션을 원심 분리기.
- 단계 5.5에서 설명한 세포 세척을 반복합니다. 전체에서 세포는 미디어와 세포의 표면에 잔류, 무료 대비 에이전트를 제거하는 세 번 씻어서 것입니다.
- 세포가 이전 세척시 손실됩니다로서 가장 정확한 셀 카운트를 달성하기 위해이 시점에서 세포를 세어보세요. 세포의 생존 테스트를 수행합니다. 세포는 이제 이후 분석 및 실험 또는 응용 프로그램에 대한 준비가되어 있습니다. MR 영상은과 T1 - W로 수행할 수 T2 - W 매개 변수, ferumoxytol는 T2 - W 대비 에이전트이지만 때문에 ferumoxytol는 T1 효과를 전시하고 있습니다. 이미지 ferumoxytol 표시 전지하는 데 사용할 수있는 대표 T2 - W MRI 매개 변수는 다음과 같습니다 : 60-80 MS의 2000년부터 2500년까지 MS와 TE의 TR와 FSE 또는 SE_Multislice 시퀀스를. T1 - W 이미지를 얻기위한, FSE에서 TE 값 또는 SE_Multislice 시퀀스를 감소하거나 높은 TR과 낮은 TE와 GRE 시퀀스를 사용합니다. 그림 4는 표시 줄기 세포 이미징에 대한 생체내 응용 프로그램에서 가능성을 보여줍니다.
4. 대표 결과 :
라벨 세포 T2 - 가중 MR 이미지에서 어둡게 또는 중대한 부정적인 대비 효과 및 T1 - 가중 MR 이미지에 이트닝이나 긍정적인 대비 효과 (그림 2)를 보여줍니다. 세로 MR 이미징 및 생존 능력 테스트는 오일 게시물 라벨이 더 큰 MR 신호 및 레이블이 지정되지 않은 컨트롤 (데이터가 표시되지 않음)에 비해 생존 능력에없이 큰 영향을 증명하지 수행.
jove_content "> 라벨 줄기 세포는 이후 다양한 세포 유형으로 차별하거나 정맥 생체내 조사에 대한 주입 수 있습니다.
그림 1. 철 산화물 nanoparticle, ferumoxytol와 함께 줄기 세포를 라벨에 대한 도식 시간 라인.
그림 2. 세포 펠렛의 세포와 화살 크로스 섹션 thrrough eppendorf 튜브의 MR 이미지. A) 컨트롤 레이블이 지정되지 않은. B) 상당한 T2 또는 부정적인 대비 에이전트 효과 T2 - 가중 FSE 또는 SE_Multislice 영상과 T1 - 가중 GRE 시퀀스에서 T1 또는 긍정적인 대비 에이전트 효과를 입증 라벨 세포.
그림 3. 셀 화소의 세포와 eppendorf 튜브의 화살 크로스 섹션수 있습니다. 조금은 10,000으로 표시 ferumoxytol 세포 T2 - W MR 영상을 통해 검색하실 수 있습니다.
그림 4. ferumoxytol - 표시 줄기 세포의 MR 시각화는 murine 대뇌 심실로 주입. USPIO - 표시 줄기 세포없이 주사로 murine barin의) 축방향, MR 이미지. B) 코로나 축방향, C) 및 D) 화살 MR 이미지는 murine 머리에 주입 USPIO - 표시 줄기 세포 (흰색 화살표)의 T2, 부정적인 대비 효과를 묘사.
다른 혈관에서 세포를 라벨에 대한 표 1. 수량 adaptions.
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Discussion
줄기 세포 engraftments의 효능을 개선하는 것은 재생 의료의 발전을 위해 중요합니다. 생체내의 줄기 세포에 대한 비침습 시각화 기술은 크게 성공 engraftment의 결과로 이어질 메커니즘을 이해하는 능력을 향상시킵니다. 이러한 우리가 보여준 프로 시저와 같은 MR 시각화, 대한 자기 상표는 MR 영상과 함께 줄기 세포의 생체내 추적하실 수 있습니다. 자기 (磁气) 표시 줄기 세포는 이전 대상 조직으로 이식되었습니다 그리고 MR 이미징 7 주가 시각되었습니다. 장기 라벨링 및 세로 이미지는 세포 내에 8 철 산화물 nanoparticles의 lysosomal 저장으로 인해 가능합니다. 도전 그러나, 철 레이블 세포의 장기적인 감시와 일치 않습니다. 철 라벨 세포의 길이 이미징과 관련된 하나의 과제는 건강, 실용적 세포가 대비 에이전트가 daughte에 배포 분아 따위에 의해 중식있다R 전지. 딸 세포에 대비 에이전트 배포는 울퉁불퉁하고 시간이 지남에 대비 에이전트 표시된 희석 효과가 발생합니다. 철 라벨 세포의 장기적인 모니터링과 관련된 두 번째 문제는 원래 라벨, 죽은 세포 4 대비 에이전트를 출시 phagocytosed 수 있습니다 같은 macrophages와 같은 거주 phagocytes,에서 원래 라벨, 실용적 세포 사이에 차별이다. 우리 그룹은 ferumoxytol 9-11 이외의 철 산화물 nanoparticles으로 표시했다 유력한 및 apoptotic 줄기 세포 이식의 장기 신호 속도론의 차이를 확인했습니다. 미래 연구는 이러한 원칙도 ferumoxytol - 라벨 세포 이식에 적용 여부를 결정하기 위해 필요합니다.
본 연구의 잠재적인 효과 ferumoxytol 라벨이 줄기 세포 심사 아니라 차별의 용량에 전시 수도 있지만, 이전의 연구는 differen에 SPIO 선량 의존 효과를 증명하고있다, 줄기 세포의 분화 능력을 손상하지 않는 ferumoxtyol 복용량을 제안, 차별의 가능성을 손상하지 tiation 용량 및 SPIO 투입도 12, 13을 결정하실 수 있습니다.
대형 SPIOs (유체 직경> 50 NM)이 같은, 프로타민 lipofectin 및 폴리 - L - 라이신 (PLL) 3로 electroporation 또는 transfection 에이전트와 함께 단순 배양과 transfection 등 다양한 분류 기술을 통해 줄기 세포 라벨 다음 셀 추적을 위해 이전에 적용되었습니다 , 13-16., SPIOs와 셀 라벨, 전지 라벨에 대한 transfection 방법에 대해 항상 필요하지가 라벨링을 촉진하고 효율 라벨 15 증가에 대한 유익한 입증하고 있지만. 셀 라벨에 사용되었습니다 SPIOs 그러나, 상업적인 이유로 생산되고 더 이상 없습니다. 같은 ferumoxytol로 Ultrasmall SPIO (USPIO, 유체 직경 <50 NM)은, 다른 한편으로는 아직도 생산되고 있습니다하지만 transfection 에이전트의 도움이 효율적인 세포 이해 8 달성하기 위해 필요합니다. 프로타민 황산은 줄기 세포 17 대비 에이전트 phagocytic 이해를 촉진하기 USPIOs과 단지를 형성하는 임상 적용 transfection 에이전트입니다. 의 결합 FDA 승인, FDA 승인 USPIO, ferumoxytol와 프로타민 황산을 줄기 세포 추적 기술이 에이전트 오프 라벨 사용을 통해 임상 번역에 대한 가능성을 제공합니다. 참고의 ferumoxytol는 임상 실험 18 뛰어난 안전성 프로파일을 시연했다. 이러한 보여준 것과 기술을 통해 이식 세포의 직접적인 시각화는 홍보 또는 손상 성공 줄기 세포 transplantations과 임상 응용 프로그램을위한 가장 유망한 기술을 식별하는 데 도움이 요인의 더 나은 이해를 허용합니다. 임상 적용 세포 마커 및 이미징 장비의 사용과,이 영상 기술은, 원칙적으로 즉시 액세스할 수 있습니다줄기 세포 이식을 받아야 환자에게.
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Disclosures
이 연구에 대한 모든 참여자는 공개를 제공하지 않습니다.
Acknowledgments
3R01AR054458 - 02S2 :이 작품은 관절염과 Musculoskeletal 국립 연구소와 피부병에서 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | Or other base medium for desired stem cell line to be used |
| D-PBS (Ca++, Mg++ free) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen | 25300-120 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
Ferumoxytol (Feraheme) |
AMAG | 59338-0775-01 | |
| Protamine Sulfate | APP Pharmaceuticals | 22930 |
References
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