Visualization of Vascular Ca 2 + Signaling Ausgelöst durch Parakrine Derived ROS

Zusammenfassung

Eine effiziente Methode, um Einblicke in die Visualisierung der parakrine-derived ROS-Induktion von endothelialen Ca2 + Signal-Verstärkung wird beschrieben. Diese Methode nutzt die Vorteile der Messung parakrine abgeleitete ROS ausgelöst Ca2 +-Mobilisierung in vaskulären Endothelzellen in einer Co-Kultur-Modell.

Zusammenfassung

Oxidativer Stress ist in einer Reihe von pathologischen Bedingungen, einschließlich Ischämie / Reperfusionsschaden und Sepsis in Verbindung gebracht. Das Konzept von oxidativem Stress bezieht sich auf die abweichende Bildung von ROS (reaktive Sauerstoffspezies), die O ₂ ^• gehören ^-, H ₂ O ₂ und Hydroxylradikale. Reaktive Sauerstoffspezies beeinflusst eine Vielzahl von zellulären Prozessen, einschließlich der Signaltransduktion, Zellproliferation und Zelltod ^1-6. ROS haben das Potenzial, Gefäß-und Organ-Zellen direkt schädigen, und kann sekundäre chemische Reaktionen und genetischen Veränderungen, die letztlich zu einer Verstärkung der ersten ROS-vermittelte Gewebeschäden führen zu initiieren. Ein wichtiger Bestandteil der Verstärkung Kaskade, die irreversible Gewebeschäden verschärft wird die Rekrutierung und Aktivierung von zirkulierenden Entzündungszellen. Während einer Entzündung, entzündliche Zellen Zytokine wie Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF) und Interleukin-1, dieaktivieren Endothelzellen (EC) und Epithelzellen und weiteren ergänzen die entzündliche Antwort ^7. Vaskuläre endotheliale Dysfunktion ist ein fester Bestandteil der akuten Entzündung. Makrophagen dazu beitragen, die endotheliale Dysfunktion bei Entzündungen, die durch Mechanismen, die unklar bleiben. Die Aktivierung von Makrophagen Ergebnisse in der extrazellulären Freisetzung von O ₂ ^{• -} und verschiedene pro-inflammatorische Zytokine, die pathologischen Signalisierung in benachbarten Zellen ⁸ auslöst. NADPH-Oxidasen sind die wichtigsten und primären Quelle von ROS in den meisten Zelltypen. In jüngster Zeit ist es von uns und anderen gezeigt, dass ^9,10 ROS durch NADPH-Oxidasen produziert der mitochondrialen ROS-Produktion bei vielen pathophysiologischen Bedingungen zu induzieren. Daher Messung der mitochondrialen ROS-Produktion ebenso wichtig ist neben der Messung cytosolische ROS. Makrophagen produzieren ROS durch die Flavoprotein Enzym NADPH-Oxidase, die eine primäre Rolle bei Entzündungen spielt. Einmal aktiviert,phagocytic NADPH-Oxidase produziert reichlich O ₂ ^{• -,} die wichtig sind in der Abwehrmechanismus des Wirts ^11,12. Obwohl parakrine-derived O ₂ ^{• -} spielt eine wichtige Rolle in der Pathogenese von Gefäßerkrankungen, Visualisierung von parakrine ROS-induzierte intrazelluläre Signalwege wie Ca ^{2 +-Mobilisierung} ist noch Hypothese. Um ein Signal zu benachbarten Endothelzellen transduzieren ^- Wir haben ein Modell, in dem aktivierten Makrophagen als Quelle von O ₂ ^• verwendet werden entwickelt. Mit diesem Modell zeigen wir, dass Makrophagen-derived O ₂ ^{• -} auf Calcium-Signalgebung in angrenzenden Endothelzellen führen.

Protokoll

Reaktive Sauerstoffspezies können in lebende Zellen mit Oxidations-Farbstoffen (1 & 2) oder unter Verwendung von Plasmid-Sensoren (3 & 4) durch konfokale Mikroskopie gemessen werden.

1. Visualisierung der cytosolischen ROS in J774-Zellen

1. Wachsen J774.1 Maus Monozyten-Makrophagen (10 ⁶ Zellen / ml) auf Glasboden 35-mm-Platten (Harvard Apparatus) für 48 h.
2. Challenge-Zellen mit TLR-Agonisten (2 pg / ml, Lipo-Teichonsäure-TLR2-Agonist, 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3 Agonist, 1 pg / ml LPS-TLR4-Agonist) für 6 h bei 37 ° C.
   Hinweis: Makrophagen unter ähnlichen Bedingungen behandelt wurden, für die Co-Kultur-Modell Ca ^{2 +} Mobilisierung eingesetzt.
3. Fügen Sie die Oxidations-Farbstoff H ₂ DCF-DA (Invitrogen) in einer Endkonzentration von 10 uM in ECM (extrazelluläre Medium zu geben: 121 mM NaCl, 5 mM NaHCO _3, 10 mM Na-HEPES, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 1,2 mM MgSO _4, 2 mM CaCl _2, 10mM Glucose und 2,0% Dextran, pH 7,4; alle von Sigma) mit 2% BSA, Gerichte und inkubieren Zellen für 20 min vor der Anzeige unter der konfokalen Mikroskopie.
4. Nach Farbstoff Laden, visualisieren Zellen auf eine Temperatur gesteuerte Phase der eine entsprechende Imaging-System gelegt. Wir verwenden Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokalen Imaging-System mit Argon-Ionen-Laser-Quelle bei einer Anregung von 488 nm für die DCF-Fluoreszenz mit 40x Öl-Objektiv ¹³ (Abb. 1A und D) gekoppelt.
5. Analysieren von Bildern mit ImageJ Software (1,44), frei verfügbare Software von der National Institutes of Health (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij / , 1997-2009).

2. Visualisierung der MROS in J774-Zellen

1. Wachsen J774.1 Maus Monozyten-Makrophagen (10 ⁶ Zellen / ml) auf Glasboden 35-mm-Platten (Harvard Apparatus) für 48 h.
2. Fordern Sie die Zellen mit TLR-Liganden an die Meldestelle zu induzieren (2 pg / ml, Lipo-Teichonsäure-TLR2, 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 pg / ml LPS-TLR4) für 6 h bei 37 ° C.
3. Add mitochondrialen Superoxid-Indikator MitoSOX Red (Invitrogen) in einer Endkonzentration von 5 uM in ECM mit 2% BSA, Gerichte und inkubieren Zellen für 30 min bei 37 ° C, damit geben Laden MitoSOX Red.
4. Nach Farbstoff Laden, visualisieren Zellen auf eine Temperatur gesteuerte Phase eines Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokalen Imaging-System Paar mit Argon-Ionen-Laser-Quelle bei einer Anregung von 561 nm für MitoSOX Red-Fluoreszenz mit 40x Öl-Objektiv (Abb. 1B und E).
5. Zur Kontrolle Experimente nach Farbstoff zum Laden PBS oder DMSO (negative Kontrolle) oder 2 um Antimycin A (als mitochondriale Superoxid-Generator-positive Kontrolle), um Zellen vor der Bild der Probe in 2,4 (Abb. 1C) beschrieben.
6. Analysieren Sie die Bilder mit ImageJ Software (1,44).

3. Visualizatiauf der cytosolischen ROS in stabilen Hyper-Zyto MPMVECs

1. Wir verwenden Phyper-Zyto (Evrogen) eine Säugerexpressionsvektor Kodierung eines fluoreszierenden Sensor HyPer, dass in das Zytoplasma und speziell Sinne submikromolaren Konzentration von H ₂ O ₂ ¹⁴ lokalisiert.
2. Transfizieren Murine Pulmonary mikrovaskulären Endothelzellen (MPMVECs) mit Phyper-Zyto-Vektor entweder Elektroporation oder Transfektionsreagenzien. Wir verwenden 10 x 10 ⁶ Zellen und transfizieren mit 10 ug von Phyper-Zyto via Elektroporation mit BioRad Gene Pulser Elektroporator System (250V, 500 mF). Kultur MPMVECs in DMEM Medium mit 10% FBS, essentielle Aminosäuren, endothelial growth ergänzen und Antibiotika.
   Hinweis: Nach der Transfektion Platte Zellen bei geringer Dichte Kolonie Wachstum zu erleichtern.
3. Ersetzen Medium mit komplettem Kulturmedium mit 500 pg / ml G418, 48 Stunden nach Transfektion ergänzt. Screen für Klone, die höchsten Prozentsatz von H haben yper positive Zellen und Passage HyPer positive Klone, die Anzahl von Hyper-positiven Zellen (Abb. 2) zu erhöhen.
   Hinweis: Wir verwenden Verdünnungsreihe von Zellen für die klonale Selektion einzelner Zellen und Bildschirm für eine stabile Zellen hochexprimierenden HyPer.
4. Wachsen stabil Hyper-Zyto MPMVECs auf 0,2% Gelatine beschichtete Deckgläser (80% Konfluenz). Am nächsten Tag Herausforderung Zellen mit TLR-Liganden (2 pg / ml, Lipoteichonsäure-TLR2, 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 pg / ml LPS-TLR4) für 6 h bei 37 ° C. Unbehandelte Zellen dienen als Kontrolle.
5. Nach der Behandlung, montieren Sie die Deckgläser auf Attofluor Zellkammer (Invitrogen). 1ml von pre erwärmt Hanks balanced salt solution (HBSS) in die Kammer und Ort der Kammer auf eine Temperatur gesteuerte Phase der Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokalen Imaging-System. Visualisieren und Bild Fluoreszenz ändern bei einer Anregung von 488 nm mit 40x Öl-Objektiv (Abb. 3A und D).
6. Analysieren von Bildern mit ImageJ Software (1.44) (siehe Abschnitt 6).

itel "> 4. Visualisierung der mitochondrialen ROS in stabilen Hyper-dMito MPMVECs

1. Wir verwenden Phyper-dMito (Evrogen) eine Säugerexpressionsvektor Kodierung Mitochondrien gezielte HyPer, dass in den Mitochondrien und speziell Sinne submikromolaren Konzentration von H ₂ O ₂ lokalisiert.
2. Transfizieren MPMVECs mit Phyper-dMito und generieren stabile Hyper-dMito MPMVECs folgenden Schritte in Abschnitt 3,2-3,3 beschrieben.
3. Wachsen stabil Hyper-dMito MPMVECs auf 0,2% Gelatine beschichtete Deckgläser (80% Konfluenz).
4. Am nächsten Tag Herausforderung Zellen mit TLR-Liganden (2 pg / ml, Lipoteichonsäure-TLR2, 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 pg / ml LPS-TLR4) für 6 h bei 37 ° C. Unbehandelte Zellen dienen als negative Kontrolle. Add 2 um Antimycin A (mitochondriale Superoxid-Induktor-positive Kontrolle) vor der Visualisierung Probe.
5. Nach der Behandlung, montieren Sie die Deckgläser auf Attofluor Zellkammer (Invitrogen). Add 1 ml vorgewärmten Hanks balanced salt solution (HBSS) in die KammerOrt und die Kammer auf eine Temperatur gesteuerte Phase der Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokalen Imaging-System. Visualisieren und Bild Fluoreszenz ändern bei einer Anregung von 488 nm mit 40x Öl-Objektiv (Abb. 3B, C und E).
6. Analysieren von Bildern mit ImageJ Software (1.44) (siehe Abschnitt 6).

5. Co-Kultur-Modell zur Visualisierung von parakrine-derived ROS ausgelöst Ca ^{2 +-Signalisierung} in Endothelzellen

Für die Visualisierung und Messung von [Ca ^{2 +]} i Änderungen, die wir verwenden eine Ca ^{2 +} Fluoreszenzfarbstoff Fluo-4 AM (Invitrogen).

1. Wachsen MPMVECs auf 0,2% Gelatine beschichtete 25 mm Deckgläser (80% Konfluenz).
2. Inkubieren Sie die Zellen auf Deckgläsern bei Raumtemperatur gewachsen für 30 min in ECM mit 2% BSA und 0,003% Pluronsäure mit 5 uM Fluo-4 AM (Invitrogen) Endkonzentration zu ermöglichen Beladung von Fluo-4 AM. Nach dem Laden, waschen Sie die Zellen mit experimentellen Imaging-Lösung (ECM mit 0.25% BSA) mit Sulfinpyrazon zu färben Verlust zu minimieren.
3. Nach dem Laden Fluo-4, mount Deckgläser auf Attofluor Zellkammer (Invitrogen). Fügen Sie 800μl der pre erwärmt experimentellen Imaging-Lösung in die Kammer und legen Sie es auf eine Temperatur gesteuerte Phase der Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokalen Imaging-System.
4. Mäuse (Behandlung mit LPS für 6 Stunden) mit Zell-tracker rot CMTPX (500ng/ml) (Invitrogen) in ECM mit 2% BSA ^- In einem separaten Röhrchen beschriften Sie die aktivierten oder aktivierte Makrophagen entweder von Wildtyp-oder gp91 ^phox-/ isoliert und 0,003% Pluronsäure. Waschen und die Zellen mit 200 ul der experimentellen Imaging-Lösung.
5. Add gekennzeichnet Makrophagen an fluo-4 AM beladen MPMVECs in die Kammeranordnung.
6. Notieren Sie die grüne und rote Fluoreszenz alle 3s für 10-20 min mit Carl Zeiss LSM510 Meta konfokalen Imaging-System mit einem Argon-Ionen-Laser-Quelle mit einer Anregung bei 488 und 561 nm für die Fluo-4 AM-und Zell-tracker rote Fluoreszenz respectively (Abb. 4 AC).
   Hinweis: Alternativ J774.1 Zelllinie verwendet werden, um MPMVECs Ca ^{2 +} Mobilisierung auslösen werden.
7. Analysieren Fluo-4 Fluoreszenz-Intensität Änderungen mit ImageJ Software (1.44) (siehe Abschnitt 6).

6. Datenanalyse mit ImageJ Software

Übertragen Sie die Bilder aus dem konfokalen System als. Lsm Formatdatei für die Datenanalyse erhalten. ZEN 2009 und ZEN 2010 Software mit LSM 510 Meta konfokalen Mikroskop LSM oder zur Verfügung gestellt 710 Multiphotonen konfokalen Mikroskop bzw. speichert Dateien in. Lsm Format. Wir empfehlen, diese native. Lsm Dateien für die Bildanalyse als ursprüngliche Qualität erhalten bleibt. Dieses Dateiformat kann direkt in der Bildanalyse-Programm Bild J. geöffnet werden Die folgenden Schritte bieten ein Beispiel quantitative Analyse der einzelnen Bildes. Keine zusätzlichen Plugins sind für diese Datenanalyse benötigt.

1. Open. Lsm oder. TIFF-Datei in Image J-Programm mit Datei> Öffnen
2. Klicken Sie auf die Registerkarte BILD> COLOR> SPLIT Kanäle und spaltete die grüne und DIC-Kanäle. Verwenden Sie das Bild aus dem grünen Kanal für die spätere Analyse.
3. Doppelklicken Sie auf und wählen Sie die "elliptische Pinsel Auswahl" und stellen die Pixel-Wert auf 20.
4. Für Hyper-Zyto Bilder, auf einer einzigen Zelle, um die kreisförmige Fläche von Messung zu definieren klicken. Dann drücken Sie "M"-Taste, um die Intensität des ausgewählten Bereichs zu messen. Die Werte werden in einem neuen Fenster Ergebnisse erhalten.
5. Next by holding "Shift"-Taste klicken Sie auf eine andere Zelle in einen anderen Bereich, mit der Taste "M"-Taste gefolgt wählen. Die Intensität wird in das Ergebnis-Fenster aufgezeichnet. Wiederholen Sie die Schritte 4-5 auf 50 verschiedenen Zellen.
6. Für Hyper d-mito Bilder, stellen Sie die Pixel-Wert auf 10 in den Elliptical Pinsel Auswahl. Region of Interest (ROI) muss manuell mit den Mitochondrien von bestimmten Zellen zurückgeführt werden.
7. Mit Freehand, verfolgen Sie die Region rund um den Mitochondrien und drücken Sie dann die "M". Wiederholen Sie die Schritte 6-7 auf 50 verschiedenen Zellen.
8. Kopieren Sie die mich und Werte aus dem Ergebnis-Fenster und fügen Sie ihn in einem Excel-Sheet oder eine Software, um die Ergebnisse Grundstück. Wir verwenden entweder SigmaPlot oder Graphpad PRISM, um die Daten als Grafik Grundstück.

7. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt zytosolischen und mitochondrialen ROS-Produktion nach Herausforderung mit TLR-Liganden. Vertreter konfokalen Aufnahmen zeigen Zunahme von DCF (cytosolische) und MitoSOX Red (Mitochondrien) Fluoreszenz nach 6 h Stimulation. Fluoreszenz-Änderungen wurden normalisiert und als facher ausgedrückt.

Abbildung 2 zeigt die Erzeugung von stabilen Hyper-Zyto-und Hyper-dMito Endothelzellen. Maus-Endothelzellen wurden mit Phyper-Zyto oder Phyper-dMito Plasmid-Konstrukte mittels Elektroporation transfiziert. Cells stabil exprimieren Plasmide wurden mit G418 für zwei Wochen gewählt. Nach der Selektion wurden verdünnten Zellen in 96-Well-Platten ausgesät. Einzelne Kolonien wurden isoliert und bebildert für homogene Ausdruck.

e_content "> Abbildung 3 zeigt die Messung der Endothelfunktion zytosolischen und mitochondrialen H ₂ O ₂ Ebenen. Representative konfokalen Aufnahmen zeigen Zunahme der Hyper-Zyto (cytosolische) und Hyper-dMito (Mitochondrien) Fluoreszenz nach 6 h Stimulation. Fluoreszenzintensität Veränderungen normalisiert wurden und als-fache Veränderung zum Ausdruck gebracht.

Abbildung 4 zeigt die Bewertung der Makrophagen-abgeleitete ROS induzierte endotheliale cytosolischen Ca ^{2 +-Mobilisierung.} LPS-stimulierte Makrophagen wurden auf pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen (PMVEC), die zuvor mit der intrazellulären Ca ² geladen hatte hinzugefügt ⁺ ([Ca ^{2 +]} i) Indikatorfarbstoff Fluo-4. Die Anwendung des Wildtyp-LPS-aktivierten Makrophagen hervorgerufen ein [Ca ^{2 +]} i Anstieg in PMVECs dass abgeschwächt durch Knockout von funktionellen NADPH-Oxidase wurde (gp91 ^{phox-/ -).}

Abbildung 1. Visualizatiauf der Makrophagen generiert zelluläre ROS und der mitochondrialen Superoxid. J774.1 Zellen wurden mit TLR2, 3 und 4 Liganden in Frage gestellt (2 pg / ml, Lipoteichonsäure-TLR2, 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 pg / ml LPS-TLR4). 6 h bei 37 ° C. Nach der Behandlung wurden die Zellen mit geladenen (A) zelluläre ROS-Indikator (H ₂ DCF-DA; grüne Fluoreszenz) oder (B) mitochondrialen Superoxid-Indikator (MitoSOX Red, rote Fluoreszenz). (C) Antimycin A wurde als positive Kontrolle für mitochondriale ROS-Produktion verwendet. Fluoreszenzintensität Veränderungen wurden anhand der konfokalen Mikroskopie. (D) und (E) Quantifizierung der mittleren Fluoreszenz ändern.

Abbildung 2. Schematische Darstellung der Generierung von stabilen Expression von endothelialen Zellen zytosolischen und mitochondrialen ROS Indikatoren.

Abbildung 3. V. isualisierung der endothelialen zytosolischen und mitochondrialen H ₂ O ₂ Ebenen MPMVECs stabil exprimieren (A) Hyper-Zyto oder (B) Hyper-dMito wurden mit TLR2, 3 und 4 Liganden (2 pg / ml, Lipoteichonsäure-TLR2 herausgefordert; 10 ug / ml, Poly (I: C)-TLR3, 1 pg / ml LPS-TLR4) für 6 h bei 37 ° C. (C) Antimycin A wurde als positive Kontrolle für mitochondriale ROS-Produktion verwendet. Nach der Behandlung wurden Fluoreszenzintensität Veränderungen beurteilt mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. (D) und (E) Quantifizierung der mittleren Fluoreszenz ändern.

Abbildung 4. Makrophagen-abgeleitete ROS entlocken beeinträchtigt Endothelzellen Ca ^{2 +-Mobilisierung.} (A) Schematische Darstellung von Endothelzellen / Makrophagen-Co-Kultur-Modell zu studieren. (B) Frisch isolierte murine Makrophagen sowohl aus WT und gp91phox null Mäuse (The Jackson Laboratory) wurden von 1 pg / ml LPS für 6 h aktiviert MacropHages wurden mit Zell-tracker Red (rot) markiert und fügte hinzu, auf Fluo-4 beladen PMVECs (grün) bis parakrine O ₂ ^{• zu} beurteilen, ^-. Signalisierung (C) LPS-aktivierten Makrophagen von WT Mäusen isoliert ausgelöst große und schnelle Ca ^{2 +-Mobilisierung} in PMVECs zu Makrophagen aus gp91phox null Mäusen verglichen. Validierung von Makrophagen-Aktivierung wurde bereits unter Beweis gestellt.

Diskussion

Die hier beschriebene Methode ermöglicht eine schnelle und quantitative Messung von reaktiven Sauerstoffspezies in lebenden Zellen entweder durch Oxidation Farbstoffe oder Plasmid-Sensoren. Agonisten der TLRs (Toll-like-Rezeptoren) sind Verbindungen, die Zellen durch die TLRs präsentieren auf der Zelloberfläche zu stimulieren und lösen die nachgeschalteten Signalwege ^15. In unserem Protokoll haben wir drei verschiedene TLR-Agonisten nämlich, Lipo-Teichonsäure-TLR2-Agonist, Poly (I: C). TLR3-Agonist, LPS-TLR4-...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagens	Firma	Katalog-Nummer
Attofluor Zellkammer	Invitrogen	A7816
Antimycin A	Sigma Aldrich	A8674
DMEM Low Glucose-Medium	Invitrogen	10567-014
Endothelial Growth Factor ergänzen (ECGS)	Upstate	02-102
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	12662011
G418	Invitrogen	10131-027
Gelatine	Sigma Aldrich	G1393
H 2 DCFDA	Invitrogen	D-399
LPS	Sigma Aldrich	L4516
LTA	Sigma Aldrich	L2515
MitoSOX Red	Invitrogen	M36008
Opti-MEM I Reduzierte Serum Medium	Invitrogen	51985091
Pen / Strep (10x)	Invitrogen	15140163
Phyper-Zyto	Evrogen	FP941
Phyper-dMito	Evrogen	FP942
Poly (I: C)	Sigma Aldrich	P0913
Prism Software 5.0	GraphPad Software, Inc.
SigmaPlot 11,0	Systat Software, Inc.
Trypsin-EDTA (10x)	Invitrogen	15400054
T-25 Flaschen	Corning	430639
T-75 Flaschen	BD Falcon	353136
96-Loch-TC Mikro-Well-Platte	BD Falcon	353072
Zen 2009 Software	Carl Zeiss 510 META konfokale Mikroskopie