In diesem Protokoll eine Methode, um intrazelluläre Protein Rückfaltung nach Hitzeschock Maßnahme beschrieben. Diese Methode kann verwendet werden, um foldases wie molekulare Chaperone und ihr Co-Faktoren oder Verbindungen in der Lage, ihre Tätigkeit Einfluss zu studieren. Firefly Luciferase-Aktivität wird als Reporter Chaperon Rückfaltung Aktivität zu messen.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um die enzymatische Aktivität der molekularen Chaperone in der Zelle-basierten System und die möglichen Auswirkungen von Verbindungen mit inhibitorischen / stimulierende Aktivität zu messen. Molekulare Chaperone sind Proteine, die bei der Regulation der Proteinfaltung 1 beteiligt und spielen eine entscheidende Rolle bei der Förderung der das Überleben der Zelle auf Stress Beleidigungen wie Hitzeschock 2, Nährstoff Hunger und die Exposition gegenüber Chemikalien / Gifte 3. Aus diesem Grund Chaperone gefunden werden, um in Veranstaltungen wie Tumor-Entwicklung, chemioresistance von Krebszellen 4 sowie Neurodegeneration 5 beteiligten werden. Design von kleinen Molekülen in der Lage zu hemmen oder stimulieren die Aktivität dieser Enzyme ist daher eine der am besten untersuchten Strategien zur Krebstherapie 7 und neurodegenerativen Erkrankungen 9. Der Test hier beschrieben bietet die Möglichkeit, die Rückfaltung Aktivität eines bestimmten molekularen Chaperon zu messen und die Wirkung von comp-Studieounds über ihre Tätigkeit. Bei dieser Methode wird das Gen des molekularen Chaperon untersucht wird zusammen mit einem Expressionsvektor kodiert für die Firefly-Luciferase-Gen transfiziert. Es wurde bereits beschrieben, dass denaturierte Luciferase durch molekulare Chaperone 10,11 kann gefaltet. Als Normalisierung Transfektion kontrollieren, ist ein Vektor-Codierung für die Renilla-Luciferase-Gen transfiziert. Alle Transfektionen in diesem Protokoll beschriebenen sind mit X-treme Gene 11 (Roche) in HEK-293 Zellen durchgeführt. Im ersten Schritt wird die Proteinsynthese durch Behandlung der Zellen mit Cycloheximid gehemmt. Danach Proteinentfaltung wird durch Hitzeschock bei 45 ° C für 30 Minuten induziert. Nach Wiederaufnahme bei 37 ° C, sind Proteine wieder zusammengefaltet in ihre aktive Konformation und Aktivität der Firefly-Luciferase als read-out verwendet: je mehr Licht produziert wird, desto mehr Protein wird die ursprüngliche Konformation wieder gewonnen. Non-Hitzeschock-Zellen sind als Referenz (100% des refolded gesetztLuciferase).
Protokoll
1. Aussäen der Zellen
- Bevor Sie beginnen, wärmen das Kulturmedium, das PBS 1X und das Trypsin in einem Wasserbad bei 37 ˚ C
- Nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator und saugen das Medium.
- Sanft gelten 5 ml PBS 1X auf die Zellen, um sie zu waschen.
- Saugen Sie das PBS 1X und gelten 1 ml Trypsin enthält 0,025% EDTA.
- Vorsichtig dreht die Platte um eine gleichmäßige Verteilung des Trypsin haben.
- Legen Sie die Zellen im Brutschrank bei 37 ˚ C für 5-10 Minuten (je nach Zelltyp). Von Zeit zu Zeit überprüfen, ob Zellen werden durch Schütteln der Platte abgelöst.
- Resuspendieren der Zellen in 10-20 ml Medium ....
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Diskussion
In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur intrazellulären Rückfaltung Aktivität der molekularen Chaperone Maßnahme vorgestellt. Der ganze Test kann in 3 bis 4 Tagen durchgeführt werden, wie die Übersicht in Abb. gezeigt. 1.
Die Robustheit und Linearität des Lichtsignals durch die Glühwürmchen und die Renilla-Luciferase produziert stellen eine solide Basis für die Reproduzierbarkeit des Protokolls.
Der entscheidende Schritt des Tests ist die Wahl ei.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Danilo Maddalo ist ein Empfänger ein Forschungsstipendium als Young Investigator Group (YIG) aus dem Karlsruhe Institute of Technology.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
Aus diesem Experiment wurde ein Luminometer Form Perkin Elmer '1420 Lumineszenz Counter 'Vector Light' wurde verwendet,
Programme für das Luminometer:
Renilla: Pumpe 1, 100 ul Injektion
Reaction Buffer: Pump1, 70 ul Injektion
Luciferin: Pumpe2, 30μl Injektion
Für die Puffer bereiten diese Stammlösungen in doppelt destilliertem Wasser:
- - 1M MgSO 4: 246,48 g MgSO 4 * 7H 2 O in 1 Liter
- - 0,5 M EGTA: 190,18 g EGTA in 1 Liter
- - 1M KH 2 PO 4: 136,09 g KH 2 PO 4 in 1 Liter
- - 1M K2 HPO 4: 228,23 g K 2 HPO 4 * 3H 2 O in 1 Liter
- - 5M NaCl: 292,2 g NaCl in 1 Liter
- - 0,5 M EDTA: 186,12 g EDTA · 2H 2 O in 1 Liter
Gly-Gly-Puffer:
- - 25mm Glycylglycin
- - 15mm MgSO 4
- - 4mm EGTA
Für 1 Liter Einsatz 3,3 g Glycylglycin, 15ml einer 1M MgSO4-Lösung und 8ml einer 0,5 M EGTA-Lösung. Lösen in Wasser, pH-Wert auf 7,8 und bringen bis zu einem Gesamtvolumen von 1 Liter.
Reaktionspuffer für Renilla / Coelenterazin Puffer:
- - & Nbsp; 13,4 mM KH 2 PO 4
- - 86,6 mM KH 2 PO 4
- - 0,5 M NaCl
- - 1mM EDTA
Für 1 Liter nutzen 13,4 ml einer 1M KH 2 PO 4-Lösung, 86,6 ml einer 1M K 2 HPO 4-Lösung, 100ml einer 5M NaCl-Lösung und 2 ml einer 0,5 M EDTA-Lösung.
| Firma | Katalog / Artikelnummer: | |
| DMEM (Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium 1X) | GIBCO | 41966029 |
| Fetal Bovine Serum Gold- | PAA | A15-151 |
| X-treme Gene 9 DNA Transfektionsreagenz | Roche | 06365809001 |
| PBS Dulbeccos Phosphate Buffered Saline 1X | GIBCO | 14190-094 |
| MOPS 3 - (N-Morpholino) propansulfonsäure | SIGMA-ALDRICH | M1254 |
| Cycloheximid | SIGMA-ALDRICH | C7698 |
| Passive Lysis Buffer 5X | Promega | E194A |
Glycylglycin | SIGMA-ALDRICH Roth Roth | G7278 3054,2 P027.1 |
KH 2 PO 4 | Roth Roth Roth Roth | 3904,1 6878,2 3957,1 8043,1 |
| Luciferin Firefly | Biosynth | L8200 |
| Coelenterazin | Biosynth | C7000 |
| DTT (Dithiothreitol) | Roth | 6908,2 |
| ATP (Adenosin Triphosphat) | Roche | 10519987001 |
Referenzen
- Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. Molecular chaperones and protein quality control. Cell. 125, 443-443 (2006).
- Ritossa, F. Discovery of the heat shock response. Cell Stress Chaperones. 1, 97-97 (1996).
- Hendrick, J. P., Hartl, F. U.
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Nachdrucke und Genehmigungen
