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Methodenartikel

Germ Cell Transplantation und Hodengewebe in Mäusen Xenografting

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⸱

DOI:

10.3791/3545

⸱

6. Februar 2012

 ,  , 
1Department of Comparative Biology and Experimental Medicine, University of Calgary

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Protokolle für die Keimzelle der Transplantation und Hodengewebe Xenografting werden beschrieben. Germ-Transplantation führt zu Donor-derived Spermatogenese in den Empfängerländern Hoden und eine funktionelle Rekonstitution Assay für die Identifizierung von Spermatogonien-Stammzellen (SSC). Hodengewebe Xenografting reproduziert Hodenentwicklung und Spermatogenese verschiedener Spender Arten in Empfängermäuse.

Zusammenfassung

Keimzelle der Transplantation wurde von Dr. Ralph Brinster und Kollegen an der University of Pennsylvania im Jahr 1994 1,2 entwickelt. Diese bahnbrechenden Studien zeigten, dass die Mikroinjektion von Keimzellen von Mäusen fruchtbaren Spender in die Samenleiter des unfruchtbaren Empfängermäuse Ergebnisse in Donor abgeleitete Spermatogenese und Spermien durch den Empfänger Tier 2. Die Nutzung von Spender männlichen Trägern die bakterielle β-Galactosidase-Gen erlaubte die Identifizierung Donor abgeleitete Spermatogenese und Übermittlung des Donor Haplotyp an die Nachkommen durch den Empfänger Tiere 1. Überraschenderweise, nach der Transplantation in das Lumen der Tubuli seminiferi, waren transplantierten Keimzellen in der Lage, von der luminalen Kompartiment zu dem Basalmembran, wo Spermatogonien 3 angeordnet sind zu bewegen. Es ist allgemein anerkannt, dass nur SSCs der Lage, die Nische und wieder herzustellen Spermatogenese in den Hoden zu kolonisieren Empfänger sind. Daher KeimzelleTransplantation bietet einen funktionalen Ansatz, um die Stammzell-Nische in den Hoden zu studieren und zu vermeintlichen Stammsamenzellen charakterisieren. Bis heute ist Keimzelle Transplantation verwendet werden, um grundlegende Stammzellbiologie aufzuklären, um transgene Tiere durch genetische Manipulation der Keimzellen vor der Transplantation 4,5 zu produzieren, zu Sertoli-Zell-Interaktion Keimzelle 6,7, SSC Homing und Kolonisierung 3-Studie 8, sowie SSC Selbsterneuerung und Differenzierung 9,10.

Germ-Transplantation ist auch in großen Spezies 11 machbar. In diesen sind die Hauptanwendungen Erhaltung der Fruchtbarkeit, die Verbreitung von Elite Genetik in Tierpopulationen, und die Erzeugung von transgenen Tieren, wie die Studie der Spermatogenese und SSC Biologie mit dieser Technik ist, logistisch schwieriger und teurer als bei Nagern. Die Transplantation von Keimzellen aus großen Arten in die Samenleiter von Mäusen führt zu colonization von Spenderzellen und Spermatogonien Expansion, aber nicht in ihrer vollen Differenzierung vermutlich aufgrund der Inkompatibilität des Empfängers somatische Zell-Kompartiment mit den Keimzellen von phylogenetisch entfernten Spezies 12. Ein alternativer Ansatz ist die Transplantation von Keimzellen aus großen Arten zusammen mit den sie umgebenden somatischen Fach. Zunächst berichtete im Jahr 2002, dass kleine Fragmente von Hodengewebe aus unreifen Männchen unter die Rückenhaut von immundefizienten Mäusen transplantiert in der Lage, zu überleben und zu unterziehen volle Entwicklung mit der Produktion von Spermien Befruchtung zuständig sind 13. Seitdem Hodengewebe Xenografting hat sich gezeigt, dass bei vielen Arten erfolgreich und entpuppte sich als wertvolle Alternative zu Hodenentwicklung und Spermatogenese der großen Tiere bei Mäusen 14 zu studieren.

Protokoll

TEIL A. Germ-Transplantation bei Mäusen

1. Herstellung von Empfängermäuse

  1. Die Empfänger sollten immunologisch tolerant (entweder genetisch an die Spender oder immundefizienten abgestimmt) an die Spender Hoden-Zellen.
  2. Die Empfänger sollten entweder von Natur aus frei von Spermatogenese (zB W / W v Mäuse) oder abgereichertes endogener Keimzellen. Germ Zell-Depletion kann durch Bestrahlung oder Chemotherapeutika wie Busulfan erreicht werden. In diesem Protokoll beschreiben wir die Verfahren zur Herstellung von Empfängermäuse mit Busulfan.
  3. Gönnen Empfänger bei 4-6 Wochen alt durch ip-Injektion von Busulfan. Die optimale Dosis von Busulfan ist Belastung abhängig. In häufigsten verwendeten Rezipientenstämme, ist eine Dosis von 40-50 mg / kg ausreichend ist, um endogenen Keimzellen (zB 44 mg / kg für Nacktmäuse, 50 mg / kg für B6/129 F1 Empfänger). Führen
  4. Pulver auflösen Busulfan in DMSO und fügen Sie dann ein gleiches Volumen an sterilem destilliertem Wasser to tätigt eine abschließende Konzentration von 4 mg / ml. Halten Sie warme Lösung bei 35-40 ° C zu verwenden, um vor Fällung von Busulfan zu vermeiden. Entsorgen Lösung, wenn Niederschläge zu beobachten ist.
  5. Nach Busulfan Behandlung, mindestens einen Monat vor der Verwendung die Empfänger zu ermöglichen. Die Empfänger können zwischen 1 Monat und 3 Monate nach der Busulfan Behandlung verwendet werden.

2. Herstellung von Mikroinjektion Pipetten

  1. Wählen Sie Borosilikatglas Pipetten (Kapillarröhrchen) mit einem 1,0 mm Außendurchmesser, einer 0,75 mm Innendurchmesser, und einer Länge von 3 Zoll.
  2. Silikonisieren Glaspipetten mit Sigmacote gründlich Pipetten mit Methanol und trocken blasen.
  3. Ziehen Sie die Pipette mit einer Pipette Abzieher. Verschiedene Pipette Abzieher Maschinen haben unterschiedliche Einstellungen, daher ein paar Einstellungen zu testen. Im Allgemeinen kann ein Setting ähnlich dem, dass zur Herstellung Enukleation verwendeten Pipetten arbeiten.
  4. Brechen Sie die Pipettenspitzen unter Seziermikroskop vor dem Gebrauch auf einen Durchmesser von etwa 50 um zu erreichenan der Spitze.

3. Herstellung von Spenderzellen für die Transplantation

  1. Choise von Donor-Stamm ist abhängig von der experimentellen Frage und untersucht. Wenn Quantifizierung der Spermatogenese als Endpunkt benutzt wird, muss der Spender mit einem leicht identifizierbaren genetischen Marker wie Lac-Z (zB B6.129S7-Gt (ROSA) 26Sor / J vom Jackson Laboratory) oder GFP (zB C57BL/6-Tg ( CAG-EGFP) 1Osb / J vom Jackson Laboratory).
  2. Planen Sie 7 ml Collagenase in DMEM bei 1 mg / ml, 4 ml Trypsin-EDTA (0,25% Trypsin zzgl. 1 mM EDTA), und 2 ml DNase in DMEM bei 7 mg / ml. Dieser Betrag ist für die Verdauung von 2 Spender Mäusehoden.
  3. Sammle Hoden aseptisch und entfernen Sie die Tunica albuginea. Spread-Hodenkanälchen vorsichtig mit einer feinen Pinzette, um enzymatische Verdauung zu erleichtern.
  4. Transfer-Tubuli in Kollagenase, bei 37 ° C für 5-10 min, und häufig schütteln inkubieren.
  5. Waschen Sie Tubuli zweimal durch Spinnen (200-300 g für 3 min) und Resuspendieren in PBS w / o Ca 2 + +
  6. Resuspendieren Tubuli in Trypsin-EDTA und schütteln, bis sie klebrig und trübe geworden. Überwachen Sie die Verdauung von Tubuli bei 37 ° C, da sollte in 1-2 min auftreten.
  7. Fügen Sie DNase und gut schütteln. Inkubieren Sie für 1-2 min.
  8. Zusatz von 3 ml FBS, um die Aktion von Enzymen zu stoppen.
  9. Einschränken Zellsuspension unter Verwendung eines Nylon Netzkappe mit 40-70 &mgr; m Porengröße zu Zelle / Gewebe Brocken zu entfernen.
  10. Collect-Zellen bei 600 g für 5 min und erneut zu suspendieren Zellen in einem kleinen Menge von DMEM (<100 ul).
  11. Zählen von Zellen und die Lautstärke auf einen gewünschten Endkonzentration (in der Regel 100 x 10 6). Halten Sie Zellsuspension auf Eis vor der Verwendung.
  12. Jeder Busulfan-behandelten Maus Hoden wird mit nur 10-15 ul Zellsuspension gefüllt werden. Aufgrund möglicher Abfall-und Auslaufen, zielen darauf ab, 30-50 ul pro Hoden haben.

4. Transplantation Verfahren (Abbildung 1)

  1. Betäuben Empfänger nach genehmigten Protokollen.
  2. Platz in RückenlageLiegen und chirurgisch bereiten den Bauchbereich. Machen Sie einen ~ 1cm Mittellinie Bauchschnitt, um die Bauchdecke entlarven. Heben Sie Bauchdecke mit Hilfe von kleinen Zangen an der Stelle der weißen Linie zu vermeiden, versehentlich verletzt Bauchorgane, und fahren Sie mit einem ~ 0,5 cm lange Inzision in der Mittellinie der Bauchwand, die Bauchhöhle aussetzen zu machen.
  3. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Iris Bauchdecke halten, und verwenden Sie ein anderes Paar von Iris Zange für die Fettpolster an den Nebenhoden und Hoden in der Bauchhöhle zu suchen. Ziehen Sie das Fettpolster heraus, bis der Hoden wird entäußert und die Hoden und Nebenhoden Arterie sind deutlich sichtbar. Arbeit an einem Hoden auf einmal.
  4. Legen Sie eine dünne sterile Abdeckung von autoklavierten Karteikarten unter dem Fettpolster / Hoden für eine bessere visuelle Identifizierung (optional) gemacht. Der Faltenwurf funktioniert auch, um Flüssigkeit zu absorbieren.
  5. Einen Tropfen Trypanblau in die Zellsuspension vorsichtig und laden Sie die Zellsuspension in das Polyethylenlene einen Schlauch mit einer 1 ml Spritze verbunden ist. Befestigen Sie die gezogen Pipette in der Rohrleitung und sanft zwingen die Zelle Suspension in der Pipette durch Aufbringen von Druck auf die Spritze auf.
  6. Identifizieren Sie die Ausführungsgänge (die die Hoden auf den Nebenhoden verbinden) und entfernen Sie vorsichtig Fettgewebe rund um die Kanäle. Arbeiten Sie sorgfältig, wie die Kanäle und die Membran um sie durchscheinend sind.
  7. Stecken Sie vorsichtig mit der Pipette in einen Kanal im Bündel Ausführungsgänge, sanft fädeln einige mm in Richtung der Hoden.
  8. Während Vermeidung von bewegten die Injektionspipette, für die Spritze zu erreichen, sanft drücken Sie den Kolben der Spritze um sicherzustellen, dass die Suspension in den Rete testis und Tubuli seminiferi strömt anfangen zu füllen.
  9. Die Injektionsrate und den Fluss von Zellsuspension wird mit dem Daumen Druck reguliert wird. Vermeiden Sie plötzliche Erhöhung des Drucks; Kontrolle der Beförderung Suspension in Tubuli.
  10. Stoppen Sie die Injektion wenn fast alle Oberflächen Tubuli gefüllt wurden, bevor die Hoden beginnt become ischämischen.
  11. Bringen Sie den Hoden in die Bauchhöhle. Wiederholen Sie den Vorgang auf der kontralateralen Hoden. Nähen Sie die Bauchdecke mit 6-0 Seidenfaden und schließen Sie die Haut mit Metall Wundklammern. Überwachen Mäuse auf einem Pad Erwärmung bis zur vollständigen Genesung.

5. Die Analyse der Empfänger Hoden

  1. Erlauben Sie 2-4 Monate nach der Transplantation vor der Analyse.
  2. Einschläfern den Empfänger Maus nach Tier in Pflege und Gebrauch Richtlinien und sammeln die Hoden und Nebenhoden in PBS. Wenn ein Lac-Z-transgenen Donor-Stamm verwendet worden ist, kann der Nebenhoden als positive Färbung Kontrolle verwendet werden, da es endogene Beta-Galactosidase-Aktivität aufweist.
  3. Für den Nachweis von Spenderzellen durch Lac-Z-Färbung, beheben den Hoden für 1-2 Stunde bei 4 ° C in 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS. Spülen Sie 3 x 30 min bei Raumtemperatur in lacZ Pufferspülgang.
  4. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C in LacZ-Färbung Lösung. Hoden kann als Ganzes oder nach dem Dispergieren gefärbt werdendie Tubuli.
  5. Fix und lagern in 10% neutral gepuffertem Formalin. Sofern Teile benötigt werden, verwenden neutrale schnell rot als Gegenfärbung.

TEIL B. ektopische Xenografting bei Mäusen

(Von Dobrinski und Rathi 2008 15, und Rodriguez-Sosa et al. 2011 16).

1. Sammlung von Spendergewebe

  1. Erhalten Hodengewebe durch Kastration oder Biopsie von einem Spender männlich.
  2. Ort Hoden in PBS oder Biopsien in Kulturmedium, die Aufrechterhaltung sterilen Bedingungen.
  3. Halten Sie das gesammelte Gewebe auf Eis und Transport ins Labor.

2. Herstellung von Spendergewebe

  1. Führen Sie in der Gewebekulturabzug zur Aufrechterhaltung der Sterilität.
  2. Waschen Sie jeden Hoden in eiskaltem PBS mit Antibiotika zwei bis drei Mal vor der Übertragung in eine Kultur-Schale mit PBS. Im Falle von Biopsien, waschen Hoden Fragmente zwei-bis dreimal mit eiskaltem Kultur medium die Antibiotika enthalten, durch Drehen bei 150g für 2 min und Resuspendieren in frischem eiskaltem Kulturmedium.
  3. Für intakte Hoden entfernen Tunica vaginalis durch einen Einschnitt entlang der Oberfläche und extrudieren die Hoden. Entfernen von Hoden aller Anhang Strukturen (Samenstrang, Nebenhoden, Bindegewebe). Waschen Hoden einmal in kaltem PBS und Überführung in eine Kultur-Schale mit PBS.
  4. Entfernen Sie vorsichtig die Tunica albuginea des Hodens mit einem Skalpell und eine Schere. Wenn der Hoden sehr klein ist, kann die Tunica durch Zusammendrücken des Hodengewebe Stelle von der Tunica durch einen kleinen Einschnitt verfügt am einen Ende, während die Tunica mit einem Paar von kleinen Pinzette am anderen Ende entfernt werden.
  5. Je nach Größe des Hodens entweder die gesamte Hodengewebe können in kleine Stücke von der Umgebung von 1 zugeschnitten - 2 mm 3 in der Größe unter Verwendung einer gebogenen Pinzette und ein Skalpell-Klinge, oder große Stücke von Hodengewebe kann zunächst aus dem Hoden entfernt werden und dann schneiden in kleinereStück. All dies sollte in eiskaltem Kulturmedium und unter sterilen Bedingungen in einem kleinen Kulturschale (60 x15 mm) erfolgen.
  6. Übertragen Sie die vorbereiteten Gewebestücke zu eiskaltem Kulturmedium in kleinen Kultur-Gerichte auf Eis, bis Pfropfen.

3. Kastration von Empfängermaus

  1. Betäuben Maus wie oben vorbereiten und sterile OP-Feld durch Schneiden der Haare (nicht notwendig in Nacktmäusen), Abreiben mit 70% Ethanol und Betadine Lösung.
  2. Machen Sie einen 0,5 -1 cm ventralen Mittellinie Hautschnitt, um die Bauchdecke entlarven.
  3. Sorgfältig Setzen Sie den Hoden, die Hoden und Nebenhoden Arterie wie in TeilA, 4,2-4,3 beschrieben.
  4. Nehmen Sie den Schwanz der epidydimis aus dem Gubernaculum durch stumpfe Präparation.
  5. Ligieren der A. testicularis und der Samenleiter gemeinsam mit dem Blutgefäß mit Seide, und Abschnitt die ligierten Strukturen durch Schneiden zwischen den Hoden und der Ligatur.
  6. Wiederholen Sie den Vorgang für das secoND Hoden.
  7. Nähen Sie die Bauchdecke mit einem oder zwei chirurgischen Nähten.
  8. Schließen Sie den Hautschnitt mit einem oder zwei Michel-Clips.

4. Ektopische Xenografting

  1. Positionieren Sie die Maus im ventralen Liegen und bereiten einen sterilen OP-Feld auf dem Rücken wie oben.
  2. Je nachdem wie viele Transplantate werden ausschliesslich zum eingefügt (in der Regel 4-8/mouse) werden, machen ~ 0,5 cm lange Hautschnitte auf jeder Seite der Mittellinie der Rückseite der Maus.
  3. Verwenden einer Pinzette, um einen Rand der Hautschnitt zu halten, und machen einen Hohlraum, der durch subkutane Hänseleien auseinander das Bindegewebe mit einer Schere.
  4. Mit Hilfe einer Pinzette Iris Ort ein Stück Hodengewebe tief in das subkutane Hohlraum, hält die Grenze der Hautschnitt mit einem anderen Iris Zange.
  5. Schließen Sie den Hautschnitt mit einem Michel-Clip und halten der Maus auf Heizkissen, bis er aus der Narkose zu erholen beginnt.
  6. Übertragen Sie die Maus an einem Käfig mit zusätzlicher Dämmung und CoVer-und Monitor, bis Mäuse werden vollständig erholt.

5. Sammlung von Hoden Xenotransplantate für Analyse-und Samenzellen der Ernte

  1. Einschläfern den Host-Maus nach Tierpflege und Leitlinien für die Verwendung, und machen eine Mittellinie Hautschnitt an der Rückseite der Haut ab dem Schwanz an den Hals und offene Haut. Dies macht die Transplantate, die entweder auf dem subkutanen Gewebe lokalisiert werden kann oder an der Haut befestigt.
  2. Entfernen Sie vorsichtig die Transplantate unter Verwendung eines Paares Zange und eine Schere.
  3. Rekordzahl von Transplantaten erholt, Größe und Gewicht der einzelnen Transplantate.
  4. Herumführen Samenblasen aus dem Bauch der Maus und aufzeichnen ihr Gewicht als Hinweis auf Testosteron-Produktion durch die transplantierten Gewebes.
  5. Für die histologische Analyse
    1. Suspend-Xenotransplantaten in Probenfläschchen mit Bouin-Lösung (oder andere Fixativ) in einem Volumen ~~~V dass der Xenograft-10x, und Etikett Fläschchen angemessen.
    2. Bebrütenüber Nacht im Kühlschrank durch Waschen mindestens 3-mal in 70% Ethanol in Abständen von 24 Stunden vorzugsweise gefolgt.
    3. Gehen Sie für die Bearbeitung und Einbettung in Paraffin.
  6. Für Spermien Ernte
    1. Waschen Sie Xenotransplantate durch Spinnen sie sich an 300g für 1 min und Resuspendieren sie in Kulturmedium mit Antibiotika enthielt.
    2. Schneiden Sie Transplantate in kleine Stücke hacken und vorsichtig mit der Pinzette in einem Gewebe Kulturschale mit 3 bis 5 ml Kulturmedium.
    3. Filter zerkleinerte Gewebe durch die Zelle 40 um Sieb.

TEIL C. repräsentative Ergebnisse

1. Germ-Transplantation

Wenn die transplantierten Spender-Zell-Suspension enthält Stammsamenzellen Tragen eines genetischen Markers wie des LacZ-Transgen, Kolonisierung der Spender SSCs in den Empfängerländern Hoden kann durch X-gal-Färbung sichtbar gemacht, wie markanten blauen Segmente des SEMiniferous Tubuli nach 2-3 Monate nach der Transplantation 3 (Abbildung 2A). Eine gut etablierte Kolonie sollte eine lange dunkelblaue Strecke komplett gefüllt Segmente mit zwei oder mehr Schichten von blauen Zellen näher an das Zentrum, und relativ schwächer gefärbte Bereiche an beiden Enden haben, wo ein Netzwerk von einzelnen, gepaart oder kleine Gruppen von blauen Zellen ist ersichtlich, 3 (Abbildung 2B). Ein Querschnitt des dunkelblauen Samenkanälchens Region zeigen sollte, gut etablierte und gut organisierte Spermatogenese mit blauen Keimzellen in verschiedenen Stadien Differenzierung (Abbildung 2C).

2. Hodengewebe Xenografting

Die Lebensfähigkeit der Hodengewebe nach der Transplantation ist invers mit der Entwicklungsstufe des Spenders korreliert; das beste Ergebnis wird erzielt, wenn Gewebe von männlichen Neugeborenen verwendet wird, während die adulten Gewebe zeigt eine hohe Tendenz zu degenerieren und sterben 17-21. Im allgemeinen nimmt Xenograft Erfolg als Spendergewebe durchläuft michiosis von der ersten Welle der Spermatogenese. Zeit bis zur vollen Entwicklung der unreifen Spendergewebe und komplette Spermatogenese ist artspezifisch, und oft etwas kürzer im Vergleich mit Hoden in situ. Die Zahl der Hodenkanälchen mit vollständiger Spermatogenese ist variabel je nach Tierart. Während bei Schafen, Ziegen und Schweine, dass Teilnummer größer als 50% ist, in Rinder und Katzen ist es weniger als 15% 14 (Abbildung 3).

Abbildung 1
Abbildung 1. Keimzelle Transplantation Verfahren. Platz Empfänger in Rückenlage nach der Narkose und eine ~ 0,4-Zoll-Mittellinie Bauchschnitt (A). Expose Hoden durch die Rücknahme des Fettpolster an den Nebenhoden und Hoden und legen Sie eine dünne sterile Abdeckung unterhalb des Fettpolster / Hoden für eine bessere visuelle Identifizierung (B). Positionieren Sie den Hoden und Nebenhoden, so dass die Ausführungsgänge in das Fettpolster begraben erkennbar sind (C, D, E). IdentifikationUnternehmen die Ausführungsgänge und entfernen Sie vorsichtig Fettgewebe rund um die Kanäle. Ein Stück farbiges Papier oder Kunststoff können unter die Kanäle für eine bessere Visualisierung (G) abgegeben werden. Break oder schleifen die Pipettenspitze nach Anspruch der hat eine Größe von den Kanälen und Last Zellsuspension in die Pipette (H). Stecken Sie vorsichtig mit der Pipette in einen Kanal im Bündel Ausführungsgänge, sanft fädeln einige mm in Richtung der Hoden (der Pfeil in H zeigt die Richtung der Pipette Injektion und Gewindeschneiden). Ein Hoden mit erfolgreichen Injektion in den Samenleiter wird (I) gezeigt. Ts: Hoden, EP: Nebenhoden.

Abbildung 2
Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse für Keimzell-Transplantation A) einen injiziert Testis mit X-gal gefärbt. Die blauen Segmente der Samenleiter darstellen etablierten Kolonien aus transgenen Spenders SSCs (LacZ-Transgen). B) Stärkere Vergrößerung eines SSC Kolonie 3 Monate nach der Transplantation. The dunkelblau Region in der Mitte stellt komplette Spermatogenese und die hellblauen Regionen an den Enden repräsentieren wachsenden Ausdehnung der Kolonie. C) einem histologischen Schnitt des dunkelblauen Samenkanälchens (3 Monate nach der Transplantation) zeigt gut organisiert Spermatogenese. Maßstabsbalken in B und C sind 200 um und 30 um jeweils. (Zahlen aus Annu Rev Cell Dev. Biol. angepasst 2008;. 24:263-86 und Biol Reprod Juni 1999;. 60 (6) :1429-36).

Abbildung 3
Abbildung 3. Ektopische Xenografting von unreifen Hodengewebe von Großtieren in immundefizienten Mäusen. Fragmente von unreifen Hoden Spender (~ 1 mm 3) unter die Rückenhaut von immundefizienten Mäusen (A) transplantiert werden können, um zu überleben und reagieren auf Maus Gonadotropine. Als ein Ergebnis erfährt Testisgewebe komplette Entwicklung, einschließlich der Bildung der Befruchtung zuständigen Spermien (B). Sobald Hoden Xenotransplantate werden gesammelt (C)sie können für die Analyse oder zu Spermien (D) für ICSI (E) und Embryo-Erzeugungseinheiten (F) zu erhalten verwendet werden. Bars gleich 50 um (B, E und F) oder 10 um (D). (Geändert von Rodriguez-Sosa und Dobrinksi 2009 14).

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Diskussion

1. Germ-Transplantation

Keimzell-Transplantation bietet die einzig funktionierende Assay für eindeutige Bestätigung der Gegenwart von spermatogonialen Stammzellen (SSC) in einer Zellpopulation. Nur SSCs können nach Hause zu besiedeln und die SSC-Nische an der Basalmembran und initiieren Donor-derived Spermatogenese. Keimzelle der Transplantation war es möglich, zu studieren und zu manipulieren SSCs in beispielloser Weise. Die Technik wurde genutzt, um transgene Tiere durch genetische Manipulat...

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Offenlegungen

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

Arbeiten Sie auf der Autoren Labor wurde von USDA / CSREES / NRICGP (2007-35203-18213) unterstützt worden; NIH / NCRR (2 RR17359 R01-06), NIH / NIEHS (1 R21 ES014856-01A2) und Alberta Innovates - Health Solutions.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Name des Reagenzes Firma Katalog-Nummer
Collagenase (Typ IV) Sigma C5138
Trypsin-EDTA Invitrogen 25200-056
DNaseI Sigma DN25
DMEM Invitrogen 31053-028
Trypanblau-Färbung Invitrogen 15250-061
Nylon Mesh Zellsieb BD Biosciences 352340 (40 um)
352350 (70μm)
Busulfan Sigma B2635
Dünnwand Glaskapillaren World Precision Instruments TW 100-3
BD Intramedic plyethylene Schlauch (PE 100) BD CA-63018-725
Ethicon 6-0 Seidennaht Ethicon 706g
Wundklammern BD 427631
Sigmacote Sigma SL2
X-gal Sigma B4252
Kaliumferrocyanid Sigma P9387
Kaliumferricyanid Sigma P3667
Magnesiumchlorid Sigma 208337
Natriumdesoxycholat Sigma D6750
N, N-Dimethylformamid Sigma D4551
Igepal CA-630 Sigma 18896

Referenzen

  1. Brinster, R. L., Avarbock, M. R. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (24), 11303-11303 (1994).
  2. Brinster, R. L., Zimmermann, J. W. Spermatogenesis following male germ-cell transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (24), 11298-11298 (1994).
  3. Nagano, M., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Pattern and kinetics of mouse donor spermatogonial stem cell colonization in recipient testes. Biology of Reproduction. 60 (6), 1429-1429 (1999).
  4. Nagano, M., Brinster, C. J., Orwig, K. E. Transgenic mice produced by retroviral transduction of male germ-line stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (23), 13090-13090 (2001).
  5. Ryu, B. Y., Orwig, K. E., Oatley, J. M. Efficient generation of transgenic rats through the male germline using lentiviral transduction and transplantation of spermatogonial stem cells. Journal of Andrology. 28 (2), 353-353 (2007).
  6. Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C. Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche. Cell Cycle. 5 (11), 1164-1164 (2006).
  7. Oatley, M. J., Racicot, K. E., Oatley, J. M. Sertoli cells dictate spermatogonial stem cell niches in the mouse testis. Biology of Reproduction. 84 (4), 639-639 (2011).
  8. Nagano, M. C. Homing efficiency and proliferation kinetics of male germ line stem cells following transplantation in mice. Biology of Reproduction. 69 (2), 701-701 (2003).
  9. Kubota, H., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Growth factors essential for self-renewal and expansion of mouse spermatogonial stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (47), 16489-16489 (2004).
  10. Oatley, J. M., Avarbock, M. R., Telaranta, A. I. Identifying genes important for spermatogonial stem cell self-renewal and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (25), 9524-9524 (2006).
  11. Dobrinski, I. Germ cell transplantation and testis tissue xenografting in domestic animals. Animal Reproduction Science. 89 (1-4), 137-137 (2005).
  12. Dobrinski, I., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Transplantation of germ cells from rabbits and dogs into mouse testes. Biology of Reproduction. 61 (5), 1331-1331 (1999).
  13. Honaramooz, A., Snedaker, A., Boiani, M. Sperm from neonatal mammalian testes grafted in mice. Nature. 418 (6899), 778-778 (2002).
  14. Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. Recent developments in testis tissue xenografting. Reproduction. 138 (2), 187-187 (2009).
  15. Dobrinski, I., Rathi, R. Ectopic grafting of mammalian testis tissue into mouse hosts. Methods in Molecular Biology. 139, Clifton, N.J. 450-450 (2008).
  16. Rodriguez-Sosa, J. R., Schlatt, S., Dobrinski, I. Testicular tissue transplantation for fertility preservation. Fertility Preservation: Emerging Technologies and Clinical Applications. Seli, E., Agarwal, A. , Springer. New York, NY. 331-331 (2011).
  17. Rathi, R., Honaramooz, A., Zeng, W. Germ cell fate and seminiferous tubule development in bovine testis xenografts. Reproduction. 130 (6), 923-923 (2005).
  18. Rathi, R., Honaramooz, A., Zeng, W. Germ cell development in equine testis tissue xenografted into mice. Reproduction. 131 (6), 1091-1091 (2006).
  19. Kim, Y., Selvaraj, V., Pukazhenthi, B. Effect of donor age on success of spermatogenesis in feline testis xenografts. Reproduction, Fertility, and Development. 19 (7), 869-869 (2007).
  20. Arregui, L., Rathi, R., Zeng, W. Xenografting of adult mammalian testis tissue. Animal Reproduction Science. 106 (1-2), 65-65 (2008).
  21. Schlatt, S., Honaramooz, A., Ehmcke, J. Limited survival of adult human testicular tissue as ectopic xenograft. Human Reproduction. 21 (2), 384-384 (2006).
  22. Shinohara, T., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. beta1- and alpha6-integrin are surface markers on mouse spermatogonial stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (10), 5504-5504 (1999).
  23. Kanatsu-Shinohara, M., Toyokuni, S., Shinohara, T. CD9 is a surface marker on mouse and rat male germline stem cells. Biology of Reproduction. 70 (1), 70-70 (2004).
  24. Ryu, B. Y., Orwig, K. E., Oatley, J. M. Effects of aging and niche microenvironment on spermatogonial stem cell self-renewal. Stem Cells. 24 (6), 1505-1505 (2006).
  25. Costoya, J. A., Hobbs, R. M., Barna, M. Essential role of Plzf in maintenance of spermatogonial stem cells. Nature Genetics. 36 (6), 653-653 (2004).
  26. Morrow, C. M., Hostetler, C. E., Griswold, M. D. ETV5 is required for continuous spermatogenesis in adult mice and may mediate blood testes barrier function and testicular immune privilege. Annals of the New York Academy of Sciences. 1120, 144-144 (2007).
  27. Zeng, W., Snedaker, A. K., Megee, S. Preservation and transplantation of porcine testis tissue. Reproduction, Fertility and Development. 21 (3), 489-489 (2009).
  28. Jahnukainen, K., Ehmcke, J., Hergenrother, S. D. Effect of cold storage and cryopreservation of immature non-human primate testicular tissue on spermatogonial stem cell potential in xenografts. Human Reproduction. 22 (4), 1060-1060 (2007).
  29. Rathi, R., Zeng, W., Megee, S. Maturation of testicular tissue from infant monkeys after xenografting into mice. Endocrinology. 149 (10), 5288-5288 (2008).
  30. Honaramooz, A., Li, M. W., Penedo, M. C. Accelerated maturation of primate testis by xenografting into mice. Biology of Reproduction. 70 (5), 1500-1500 (2004).

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