Überwachung Proteinadsorption mit Solid-State-Nanoporen

Summary

Eine Methode der Verwendung von Solid-State-Nanoporen, die unspezifische Adsorption von Proteinen auf einer anorganischen Oberfläche überwachen beschrieben. Die Methode nutzt die resistive-Puls-Prinzip, so dass für die Adsorption in Echtzeit und in der Einzel-Molekül-Ebene untersucht werden. Da der Prozess der einzelnen Protein-Adsorption ist fern vom Gleichgewicht, schlagen wir den Einsatz von parallel Arrays von synthetischen Nanoporen, so dass für die quantitative Bestimmung der scheinbaren Reaktion erster Ordnung Geschwindigkeitskonstante der Proteinadsorption sowie die Langmuir Adsorption konstant.

Abstract

Solid-State-Nanoporen wurden genutzt, um Messungen an der Einzel-Molekül-Ebene durchzuführen, um die lokale Struktur und Flexibilität von Nukleinsäuren ^1-6, die Entfaltung von Proteinen ⁷ und Bindungsaffinität unterschiedlicher Liganden ⁸ zu untersuchen. Durch die Kopplung dieser Nanoporen der resistiven-Puls-Technik ^9-12, können solche Messungen unter einer Vielzahl von Bedingungen und ohne die Notwendigkeit für die Kennzeichnung ³ durchgeführt werden. In der resistive-Puls-Technik ist ein ionisches Salz-Lösung auf beiden Seiten des Nanopore eingeführt. Daher werden die Ionen von einer Seite der Kammer in die andere durch eine angelegte Transmembranpotential getrieben, was zu einem stetigen Strom. Die Aufteilung eines Analyten in die Nanopore Ursachen einer gut definierten Auslenkung in diesem Strom, der analysiert, um Einzel-Molekül-Informationen zu extrahieren können. Mit dieser Technik kann die Adsorption von einzelnen Proteinen, die Nanopore Wänden unter einer Vielzahl von überwacht werdenBedingungen ^13. Proteinadsorption an Bedeutung, weil sie als mikrofluidischen Bauteilen in der Größe schrumpfen, wird die Wechselwirkung dieser Systeme mit einzelne Proteine ​​ein Anliegen. Dieses Protokoll beschreibt einen Schnelltest zur Proteinbindung an Nitrid-Filme, die ohne weiteres auf andere dünne Filme zugänglich Nanopore Bohren oder zu funktionalisierten Oberflächen-Nitrid verlängert werden kann. Eine Vielzahl von Proteinen kann unter einer Vielzahl von Lösungen und denaturierenden Bedingungen untersucht werden. Darüber hinaus kann dieses Protokoll verwendet werden, um mehr grundsätzliche Probleme mit Nanopore-Spektroskopie zu erkunden.

Protocol

1. Herstellung von Solid-State-Nanoporen in Siliziumnitrid-Membranen

1. Bringen Sie die FEI Tecnai F20 S / TEM zu einer Beschleunigung von 200 kV. Wenn mit einer anderen S / TEM, sollte die Beschleunigungs-spannung größer als oder gleich 200 KV ⁹
2. Legen Sie eine 20 nm dicke SPI Siliziumnitrid Fenster Gitter in die TEM Probenhalter und sauber mit Sauerstoff-Plasma für 30 Sekunden, um alle Verunreinigungen aus der Halterung entfernen.
3. Legen Sie die Probe in die S / TEM und ermöglichen das Vakuum der Pumpe ab. Nachdem die S / TEM hat sich auf Vakuum gepumpt, finden die Nitrid-Fenster in Hellfeld-TEM-Modus durch die Suche nach einem hellen Platz am Ronchigram. Sicherstellen, dass die TEM richtig ausgerichtet ist, dann ausrichten und konzentrieren die Probe.
4. Schalten Sie das S / TEM in STEM-Modus. Verwenden Sie die HAADF (oder gleichwertig) Detektor zur Abbildung der Probe und sicherzustellen, dass sie richtig ausgerichtet ist.
5. Setzen Sie den Monochromator auf einen niedrigen Wert. Ein niedrigerer Wert der Monochromator ermöglicht eine höhere Währungent der Elektronen zur Verfügung für das Bohren. Wenn die S / TEM keinen Monochromator, ignorieren Sie diesen Schritt.
6. Wählen Sie einen geeigneten Spot-Größe für das Bohren der Nanopore. Dies entspricht dem Durchmesser des Elektrons Sonde. A 3 nm Sonde funktioniert gut für Bohrungen 5 nm Durchmesser Poren. Eine größere Sonde (5 nm) wird schneller bohren und eine größere Pore. Eine kleinere Sonde (1 nm) wird länger dauern, zu bohren und eine kleinere Pore.
7. Passen Sie die STEM Ausrichtungen, falls erforderlich.
8. Fokus der Nitrid-Membran und bringt sie zu einer Vergrößerung von x1.3M. Feinfokussieren sollte durch Überwachung der Ronchigram durchgeführt werden.
9. Wenn es eine Bewegung der Probe, dann für die Probe zu stabilisieren warten. Dies kann bis zu einer Stunde. Blank der Elektronenstrahl während der Wartezeit, um nicht das Nitrid Schäden an.
10. Ort des Elektrons Sonde auf die Probe und beginnen Bohren.
11. Überprüfen Sie regelmäßig die Probe durch Scannen mit dem HAADF Detektor, sowohl um sicherzustellen, dass die Nanopore wird driullt (es wird wie ein dunkler Fleck sehen) und zu überprüfen, dass es keine Bewegung der Probe. Wenn die Probe driftet leicht, passen Sie die Position des Elektrons Sonde über die Nanopore werden.
12. Sehen Sie sich das Ronchigram zu identifizieren, wenn die Poren gebildet hat. Wenn im Fokus hat die Nitridfilm ein schimmerndes Aussehen. Diese verschwindet, sobald die Nanopore Formen. Putting die Ronchigram leicht unscharf erlaubt es, eine Fresnel Rande mit der Nanopore verknüpft sind.
13. Nehmen Sie ein Bild von der Nanopore mit dem HAADF.
14. Haben ein Intensitätsprofil der Nanopore Bild. Der Durchmesser der Nanopore kann durch den dunkelsten Bereich des Profils geschätzt werden.
15. Erweiterung der Nanopore kann durch Verschieben der Elektronensonde an den Rändern der Poren durchgeführt werden.
16. Sobald die Nanopore ist der gewünschte Durchmesser, legen Sie die S / TEM in TEM-Modus.
17. Bringen Sie den Monochromator auf die Standard-Einstellung und Bild die Nanopore mit Hellfeld-TEM, um die Größe zu bestätigen

2. Die Benetzung der Solid-State-Nanopore

1. De-Gas-de-ionisiertes Wasser mit 1 M KCl, 10 mM Kaliumphosphat, pH 7,4. Dies kann, indem die Lösungen unter Vakuum und sie in einem Ultraschallbad für 20 Minuten durchgeführt werden.
2. Legen Sie die Nanopore mit Siliziumnitrid Chip in eine 10 ml Pyrex-Becher. Achten Sie darauf, die Nitrid-Fenster zu brechen, da es sehr empfindlich ist. Das Becherglas wird auf einer Heizplatte unter einem Abzug und auf 100 ° C.
3. Reinigen Sie die Nanopore Chip mit Piranha-Lösung mit großer Sorgfalt. Fügen Sie zunächst 3 ml Schwefelsäure in den Behälter mit einer Glaspipette. Next vorsichtig 1 ml Wasserstoffperoxid zu der Schwefelsäure zu Piranha Lösung ¹⁴ zu machen. Bitte nehmen Sie alle Vorsichtsmaßnahmen.
4. Lassen Sie die Nanopore Chip in Piranha-Lösung für 10 Minuten einweichen.
5. Entfernen Sie die Piranha-Lösung aus dem Becherglas mit einer Glaspipette. Legen Sie sie in eine geeignete Lagerbehälter.
6. Fill das Becherglas mit der de-vergast, de-ionisiertes Wasser mit einem sauberen Glaspipette. Leere Becher mit Wasser und wiederholen Sie mindestens 5-mal.
7. Entfernen Sie die Nanopore Chip mit sauberen Pinzette und trocknen Sie es durch Licht Saug-
8. Sofort verschließen Nanopore Chip in die Kammer (Abb. 2a, 2b). Der Chip in der Kammer kann durch O-Ringe oder Silikon befestigt werden.
9. Füllen Sie die Kammer mit KCl-Lösung
10. Schließen Sie die Ag / AgCl Elektroden in die Kammer (Abb. 2b). Elektroden können durch Einweichen Silberdraht in Bleichmittel über Nacht erfolgen.
11. Tragen Sie eine transmembrane Potential zwischen den Elektroden und überwacht die aktuelle Antwort mit einem Axon 200B Patch-Clamp-Verstärker in den Voltage-Clamp-Modus.
12. Konstruieren Sie einen I / V (Strom-Spannungs-) Kurve aus den Messungen. Die I / V-Kurve sollte sehr linear, wenn mit 1 M KCl (Abb. 3). Der Leitwert der Nanopore sollte zu seinem Durchmesser entspricht. Wenn die Nanopore zeigt keinelineare I / V-Kurve, die Leitfähigkeit zu niedrig ist, oder die offene Strom der Nanopore nicht stabil ist (Abb. 4a), bedeutet dies, dass die Nanopore nicht richtig benetzt und Piranha Waschen sollte wiederholt werden.

3. Überwachung Proteinadsorption

1. Es ist sehr wichtig, die Kontrolle Experimente mit einer Single-Nanopore Membran oder parallele Anordnung von Nanoporen (siehe unten), um die aktuelle mit der Puffer-Bedingungen fehlt das Protein Sample Monitor durchführen. Wir empfehlen die folgenden zwei Schritte: (i) die Verwendung eines hochreinen-Level-Puffer (Reinheit> 99,9%; Chromatographie-grade-Ebene), und (ii) die Verwendung eines Puffers, dessen Interaktion mit der Solid-State-Nanopore nicht produzieren Single-Channel-Veranstaltungen. Darüber hinaus empfehlen wir den Erhalt einer hochreinen Protein Probe mit Standard Proteinchemie Verfahren. Die Reinheit des Proteins Probe sollte durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid (SDS-PAGE)-Gel-Analyse und hochauflösende ma überprüft werdenss-Spektrometrie ^15.
2. Fügen Sie eine gereinigte Probe des Proteins in die geerdete Bad der Kammer untersucht werden. Nehmen Sie sich Zeit für die Probe in das Bad zu diffundieren. Typische Konzentrationen des Proteins, die gemessen werden können, sind in den zehn nm bis uM Bereich ^7,15-21.
3. Tragen Sie einen Transmembranpotential Vorspannung mit entgegengesetzter Polarität, die der gesamten Ladung des Proteins untersucht. Zum Beispiel hat BSA eine effektive negative Ladung bei pH 7,4, und damit eine positive Vorspannung angewendet werden sollte. Die angelegte Spannung erzeugt Potentialgradienten innerhalb der Nanopore Innenraum und Proteine ​​von entgegengesetzten Ladungen werden durch entgegengesetzte Kräfte getrieben werden. Nur Spannungspolaritäten, dass die Proteine ​​Fahrt in die Nanopore schaffen messbare Signale.
4. Eine angelegte Potential der Größenordnung von 200 mV sollte groß genug für die meisten Protein-Analyten zu beobachten. Events werden als vorübergehende aktuellen Ausschläge von der Grundlinie (Abb. 4b) erscheinen.Wenn kein Signal beobachtet wird, erhöhen die Konzentration des Proteins in der Kammer. Höhere Spannungen Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnis. Nitride Nanoporen standhalten können mehrere Volt.
5. Protein Adsorptionen werden als langlebige Veränderungen in der Baseline-Strom der Nanopore (Abb. 4c) erscheinen.

4. Möglichkeiten zur Funktionalisierung der Nanoporen

Es gibt mehrere Methoden für die Anwendung funktionellen Gruppen zu Siliziumnitrid ^22,23. Die meisten Nitrid-Filme haben eine dünne Oxidschicht auf der Außenseite und der Exposition gegenüber Ozon kann eine zusätzliche Oxidschicht, wenn nötig. Verschiedene Organosilane verwendet werden kann und self-assembled auf solche Schichten. Von besonderem Interesse ist Aminosilan, die selbst montiert und kann weiter modifiziert werden (zB Carbonsäuren und Aldehyde), so dass für die Prüfung einer Reihe von organischen Oberflächen. Nach einer Nanopore mit Piranha gewaschen worden und sicherte in der Chamber, kann Amin direkt mit der Kammer Bad mit einem Leitsalz von 0,5 M TBACl (Tetrabutylammonium) und wasserfreiem MeOH (Methanol) als Lösungsmittel verwendet hinzugefügt werden. Monolayer-Bildung kann durch die Anwendung eines 400 mV Vorspannung und die Messung der aktuellen drop ²³ überwacht werden.

5. Bestimmung der scheinbaren Reaktion erster Ordnung konstant gehalten und die Langmuir Adsorption konstant mit parallel Nanopore Arrays

5.1 Die scheinbare Reaktion erster Ordnung Geschwindigkeitskonstanten für Adsorption und Desorption

Wir betonen, dass der positive Aspekt dieser Methodik ihrer Fähigkeit, individuelle Adsorptionen an der Einzel-Molekül-Ebene zu beobachten ist. Die Einzel-Molekül-Messungen der Proteinadsorption auf einer anorganischen Oberfläche kann durch den Einsatz von parallel Arrays von Solid-State-Nanoporen skaliert werden. Die parallele Anordnung von Nanoporen ist wegen der Notwendigkeit, Assay viele Poren, um zuverlässige statistische bekommen notwendigs. Zu diesem Zweck würde die Verwendung einer Nanopore Array ermöglichen die Überwachung der einzelnen Adsorptionen sowie die Messung von mehreren Veranstaltungen zur weiteren Analyse. Ein Array von Nanoporen in Siliziumnitrid kann durch die oben Protokoll einfach durch Bohren mehrerer Löcher in der Probe gebildet werden. Jede Nanopore sollten von gleicher Größe sein. Arrays von Nanoporen von 6x6 oder 7x7 ausreichend sein sollte. Nach Zugabe von Protein Analyten in der Kammer, wird der Strom in eine exponentielle Weise mit einem folgenden Ausdruck Verfall:

I _t = I _∞ - (I _∞ - I ₀₎ exp (-k 't)

Hier, ich _t, bezeichnet den Strom bei einer experimentellen Zeitmaschine t. I ₀ ist die ursprüngliche Strom durch die Nanopore Array. I _∞ zeigt die aktuelle bei Sättigung (dh unendlich). K 'ist die scheinbare Reaktion erster Ordnung Rate konstant ist, kann die von th bestimmt werdene der experimentellen Kurve passen. Eine größere k 'kann als schneller Adsorptionsgeschwindigkeit interpretiert werden. Das Verhältnis I _∞ / I _0, auch als die normierte Sättigungsstrom, ist eine dimensionslose Zahl zwischen 0 und 1. Dieser Parameter ist ein Maß für die Belegung durch das adsorbierte Protein Analyten. Deshalb sollte jede einzelne experimentellen Bedingungen mit zwei spezifischen Ausgangsparameter I _∞ / I ₀ und k 'in Verbindung gebracht werden.

Es wird darauf hingewiesen, dass die scheinbare erster Ordnung Adsorption Geschwindigkeitskonstanten und normierten Ströme durch die effektive Zeit von Proteinen innerhalb der Nanoporen ausgegeben werden betroffen sein. Diese Zeit ist abhängig von der Konzentration des Proteins Analyten in loser Schüttung wässrigen Phase ^24. Daher muss zusätzliche Korrektur dieser Zahlen, basierend auf der effektiven Zeit von der Proteine ​​innerhalb der Nanopore Innenraum verbracht umgesetzt werden. Wir schlagen vor, die Messung der Frequenz von fast (Translokation) Veranstaltungen und Multiplikation mit der durchschnittlichen Verweildauer von solchen Ereignissen. Dies gibt die durchschnittliche Zeit von Proteinen innerhalb der Nanopore Innenraum pro Zeiteinheit ausgegeben.

Die Geschwindigkeitskonstante der Desorption kann anhand einer parallelen Anordnung von Nanoporen als gut. Sobald das aktuelle Niveau Sättigung (I _∞) erreicht, die Spannung umgekehrt werden sollte, so dass keine weiteren Proteine ​​in die Poren gefangen. Desorption einzelner Proteine ​​wird durch die Veränderung der aufgezeichneten aktuellen Richtung größere Werte begleitet werden. Die Geschwindigkeitskonstante wird dann von den Aufstieg in die aktuelle Ebene gewonnen werden.

5.2 Die Langmuir Adsorption konstant

Die Absorption von Proteinen Analyten auf die anorganischen Oberflächen der Nanoporen ist abhängig von der Protein-Konzentration in der wässrigen Phase. Dieses Phänomen wurde bereits bei der Einzel-Molekül-Ebene ¹³ beobachtet worden. Wenn θ stellen s der normierte Sättigungsstrom (I _∞ / I _0), dann eine typische Langmuir-Isotherme Gleichung wird durch den folgenden Ausdruck gegeben:

wo C die Protein-Konzentration in der wässrigen Phase ist. α ist die Langmuir Adsorption konstant. Diese Konstante steigt mit einer Zunahme der Bindungsenergie der Adsorption und mit einer Abnahme der Temperatur. Die Sammlung des θ Datenpunkte werden Messungen mit parallel-Arrays bei verschiedenen Proteinkonzentrationen in wässriger Phase durchgeführt beschäftigen. Die Daten sollten in Kombination mit anderen Techniken, um die Größe des eingebauten Langmuir Adsorption konstant überprüfen analysiert werden. Darüber hinaus könnten Full-atomistische Molekulardynamik-Simulationen ^25,26 ebenfalls verwendet werden, um die Interpretation der gewonnenen experimentellen Daten zu helfen.

Titel "> 6. Repräsentative Ergebnisse

Typische Ergebnisse für Solid-State-Nanoporen wird wie folgt sein. Die offenporige Strom sollte möglichst stabil sein, wie in Abb. gesehen. 4a. Die I / V Eigenschaften der Nanopore sollte sehr linear in 1 M KCl, 10 Kaliumphosphat, pH 7,4, wie in Abb. gesehen. 2. Die Steigung einer linearen Anpassung an die I / V-Kurve wird den einheitlichen Leitwert der Nanopore. Der Leitwert hat eine direkte Beziehung zu den Nanoporen Durchmesser und sollte die Gleichung entsprechen: , Wobei G der Leitwert der Nanopore ist, d der Durchmesser ist, l die Länge, und σ ist die Leitfähigkeit der Lösung in die Kammer ^14. Dieser Wert sollte innerhalb von 30% entsprechen. Wenn es zu klein ist, wird Ihre Poren wahrscheinlich nicht benetzt. Mit Zusatz von Eiweiß, sollte eine schnelle Ereignisse eintreten, wie in Abb. gesehen. 4b. ProtEin Adsorption ist ein langlebiger Stromabfall wie in Abb. dargestellt. 4c. Einige Proteine ​​sind sehr labil und unterliegen Strukturwandel innerhalb der Pore Innenraum. In diesem Fall wird die langlebigen Spannungsabfall durch schnelle Schwankungen begleitet werden.

Abbildung 1. Solid-State-Nanopore hergestellt unter Verwendung eines Tecnai F20 S / TEM. Die Poren in STEM-Modus zu einem Durchmesser von 20 nm gebohrt. Das Bild wurde im Hellfeld-TEM-Modus übernommen. Nitride betrug 30 nm dick.

Abbildung 2. Chamber zur Aufnahme einer einzigen Solid-State-Nanopore in resistive-Puls-Messungen verwendet. A) Kammer und einem Silizium-Chip mit freistehenden Nitrid-Fenster (TEM-Gitter). Die Nanopore in die Nitrid vor dem Laden gebohrt. Red O-Ringe verwendet, um eine gute S-Formeal über den Chip, der zwei Bäder ionischer Lösung trennt. B) Schematische Darstellung der Kammer zeigt Platzierung der Lösung Bäder und Elektroden in Bezug auf die Nanopore.

Abbildung 3. Typische I / V Spuren für Solid-State-Nanoporen mit unterschiedlichen Durchmessern. Einkanal-elektrischen Spuren wurden in 1 M KCl, 20 mM Tris, pH 8,5 aufgenommen. Nanoporen wurden in 30 nm dicken Silizium-Nitrid gebohrt. Hinweis Nitrid Dicke wirkt sich auf die einheitliche Leitwert der Nanopore.

Abbildung 4. Gemessen einkanalige aktuellen Spuren und die Detektion von Protein-Adsorption. A) A Single-Channel-elektrische Spur zeigt den offenen Strom von 10 nm Durchmesser Nanopore. B) Aktuelle Ausschläge darstellen Rinderserumalbumin (BSA) Aufteilung in die interior der Nanopore. C) Adsorption von BSA auf die Nitrid-Oberfläche. Alle Spuren sind aus dem gleichen Nanopore in 1 M KCl, 10 mM Kaliumphosphat, pH 7,4. Die angewandten Transmembranpotential war +40 mV und BSA wurde mit dem geerdeten Kammer Bad bei einer Konzentration von 120 nM aufgenommen.

Discussion

Spontane Adsorption von Proteinen an Festkörperoberflächen ^27-29 ist von fundamentaler Bedeutung in einer Reihe von Bereichen, wie Biochip-Anwendungen und Design einer neuen Klasse von funktionellen Biomaterialien Hybrid. Frühere Studien haben gezeigt, dass Proteine ​​adsorbiert Festkörperoberflächen zeigen keine seitliche Beweglichkeit oder signifikante Desorptionsraten, und deshalb Proteinadsorption ist in der Regel eine irreversible und unspezifische Prozess ^30-32 betrachtet. Protein-Adsorption ...

Materials

Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Tecnai F20 S / TEM	FEI		S / TEM erfordert Beschleunigung Spannung ≥ 200kV und Feld-Emissionsquelle.
20 nm dicken Siliziumnitrid-Membran Fenster für TEM	SPI	4163SN-BA
Axon Axopatch 200B Patch-Clamp-Verstärker	Molecular Devices
Axon Digidata 1440A	Molecular Devices
pCLAMP 10-Software	Molecular Devices		Elektrophysiologie Datenerfassung und Analyse-Software
Schwefelsäure	FFinisher Scientific	A300
Wasserstoffperoxid	Fisher Scientific	H325
Silikon O-Ringe	McMaster-Carr	003 S70	Alternativ können Sie PDMS
Silberdraht	Sigma-Aldrich	348759	Für Elektroden
SPC-Technologie, D-Sub-Kontakt, pin	Newark	9K4978	Für Elektroden
Kaliumchlorid	Sigma	P9541
Kaliumphosphat zweibasischen	Sigma	P2222
Kaliumphosphat einbasischen	Sigma	P5379
PDMS	Dow Corning		Sylgar 184 Elastomer gesetzt. Für die Herstellung Kammer.
Kwik-Cast-Versiegelung	World Precision Instruments	KWIK-CAST	Schnell wirkende Silikon-Dichtstoff
Heizplatte	Fisher Scientific
Faraday-Käfig