Quantitative Analyse der ungerichtete Migration von Zellen unter Verwendung Zeitraffer-Video-Mikroskopie

Summary

Diese Methode ermöglicht das Monitoring von Zellen in Echtzeit und quantitative Messungen verschiedener Zell-Migration Parameter wie Geschwindigkeit, Weg und Geschwindigkeit. Im Gegensatz zu den herkömmlichen Methoden ist diese Echtzeit-Ansatz nicht auf Endpunkt quantitativen Migration der Grundlage von Messungen, sondern es ermöglicht die Überwachung und Berechnung verschiedener Parameter kontinuierlich.

Abstract

Die Zellmigration ist ein dynamischer Prozess, das ist wichtig für die Embryonalentwicklung, die Reparatur von Gewebe, die Funktion des Immunsystems und Tumorinvasion ^{1, 2.} Während gerichtete Migration, zu bewegen Zellen schnell in Reaktion auf eine extrazelluläre chemotaktischen Signal oder in Reaktion auf intrinsische Signale ³ durch die grundlegende Motilität Maschine bereitgestellt. Zufällige Migration tritt auf, wenn eine Zelle besitzt niedrige intrinsische Richtwirkung, so dass die Zellen, um ihre lokale Umgebung zu erkunden.

Die Zellmigration ist ein komplexer Prozess, in der ursprünglichen Antwort Zelle erfährt Polarisation und erstreckt sich Vorsprünge in der Richtung der Wanderung ^2. Traditionelle Methoden zur Migration, wie der Boyden-Kammer Assay die Migration zu messen, ist eine einfache Methode, Chemotaxis in vitro, die Messung der Migration als Endpunkt Ergebnis erlaubt zu messen. Doch dieser Ansatz weder erlaubt die Messung der einzelnen Parameter Migration, noch erlauben zu visuasierung von morphologischen Veränderungen erfährt, dass die Zelle während der Migration.

Hier präsentieren wir eine Methode, die uns zu wandernden Zellen in Echtzeit per Video überwachen können - Zeitraffer-Mikroskopie. Da Zellmigration und Invasion Kennzeichen von Krebs sind, wird diese Methode anwendbar sein bei der Untersuchung von Krebszellen Migration und Invasion in vitro. Zufällige Migration von Plättchen nach einem der Parameter der Thrombozytenfunktion ⁴ wurde erlaubt, damit dieses Verfahren könnte auch nützlich sein bei der Untersuchung Plättchenfunktionen. Dieser Assay hat den Vorteil, dass die schnelle, zuverlässige und reproduzierbare, und erfordert keine Optimierung der Zellzahlen. Um physiologisch geeigneten Bedingungen für die Zellen zu erhalten, wird das Mikroskop mit CO _2-Versorgung und Thermostat ausgestattet. Zellbewegung wird durch das Fotografieren mit einer Kamera ausgestattet, um dem Mikroskop in regelmäßigen Abständen überwacht. Die Zellmigration durch Messung der mittleren Geschwindigkeit und einer berechneten werdenurchschnittliche Verschiebung, die durch Slidebook Software berechnet wird.

Protocol

1. Vorbereitung der Platte mit Kollagen beschichtet

1. Verdünnte Kollagen zu einer Endkonzentration von 10 ug / ml in Opti-MEM Medium.
2. Coat 6 Well-Platten mit Kollagen, durch Zugabe von 1,5 ml aus Schritt 1 in jede Vertiefung. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C
3. Am folgenden Tag, waschen Sie die Platte 2-mal mit 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) und speichern sie in PBS.

2. Zellpräparation und Seeding auf einer 6-Well-Platte

Hinweis: Verwenden Sie warmes Medien und PBS, um optimale Bedingungen für die Bewegung der Zellen zu gewährleisten

1. Wachsen MDA-MB....

Discussion

Die Echtzeit ungerichtete Migration Assay ermöglicht die präzise, ​​sensibel, Analyse der Zellmigration Parameter wie Geschwindigkeit und Auslenkung. Diese Methode beschränkt sich nicht Punkt Messwert zu beenden, daher ist es mehr quantitativ. Da die Zellen in DMEM-Medium mit normalem Serum überwacht, senkt die schädliche Wirkung von längerer Inkubation in serumfreiem Medium. Es hat sich gezeigt, dass die Migration von Zellen auf die Formatierung und Brechungszelle Kontakte mit dem Substrat ^8, so kann diese M.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
DMEM	Thermo Scientific	SH30243.01
FBS	Gemini-Bio-Produkte	100-106
Opti-MEM	Invitrogen	31985-070
Collagen	BD	354231
Mikroskop mit Live Cell Kammer & Automated XY-Controller	Olymp	Olympus 1X81
Umwelt-Steuerkammer	Neue	Neue Live Cell Kammer	Ours hat einen speziell angefertigten rechteckige Glasplatte oben für eine angemessene Optik durch den oberen Teil der Kammer. Die rechteckige Form aufnimmt Multi-Well-Platten in vielen unserer experimentellen verwendetts.
Automatisierte XY-Tisch	Vor	Vor Proscan	Dies ermöglicht eine präzise Rückkehr zum ausgewählten XY-Positionen während der Zeitraffer-Mikroskopie zu multiplizieren.
Kamera		Hamamatsu EM-Kamera C9100
Software	Typischerweise durch Mikroskop Anbieter wie Olympus gekauft	Slide Buch 5