Summary
Несколько-Target Трассировка домашнее алгоритм, разработанный для отслеживания индивидуально меченых молекул в мембране живой клетки. Эффективное обнаружение, оценку и отслеживание молекул с течением времени при высокой плотности обеспечивает удобный, комплексный инструмент для исследования наноразмерных динамика мембраны.
Abstract
Нашей целью является получить подробное описание молекулярных процессов, происходящих в клеточных мембранах в различных биологических функций. Мы стремимся характеризующие сложную организацию и динамику плазматической мембраны в одной молекуле уровне, путем разработки аналитических средств, предназначенных для Одночастичные Tracking (SPT) при высокой плотности: Несколько-Target Tracing (МТТ) 1. Одиночных молекул видеомикроскопии, предлагая миллисекунды и разрешение нанометрового 1-11, позволяет детальное представление мембраны организации 12-14, точно отображение дескрипторов, таких как клеточные рецепторы локализация, подвижность, родов или взаимодействий.
Мы вновь SPT, как экспериментально, так и алгоритмически. Экспериментальные аспекты включены оптимизации установки и мечения клеток, с особым акцентом на достижение максимально возможной плотности маркировки, с тем чтобы обеспечить динамический снимок молекулярной динамикии все происходит внутри мембраны. Алгоритмические вопросы, касающиеся каждого шага для восстановления траектории: пики обнаружения, оценки и воссоединения, рассмотрены конкретные инструменты анализа изображений 15,16. Реализация дефляции после обнаружения позволяет спасать пики изначально скрыты от соседних, более сильные пики. Следует отметить, что улучшение обнаружения непосредственно влияет на повторное, на сокращение разрыва в траектории. Выступления были оценены с использованием метода Монте-Карло для маркировки различной плотности и шум значения, которые обычно представляют собой два основных ограничения на параллельных измерений при высокой пространственно-временной разрешение.
Нанометрового точность 17 получены отдельные молекулы, используя либо последовательного включения / выключения photoswitching и нелинейной оптике, могут обеспечить исчерпывающую наблюдений. Это является основой наноскопия 17 таких методов, как STORM 18 PALM 19,20, 21 или RESOLFT Стед 22,23, бееч. часто требуют фиксированных изображений образцов. Главной задачей является выявление и оценка дифракционного пика, исходящих из одной молекулы. Таким образом, обеспечение надлежащего предположения, такие как обработка постоянная точность позиционирования, а броуновское движение, МТТ прямо подходит для наноскопических анализа. Кроме того, МТТ может принципиально быть использован на любом уровне: не только для молекул, но и для клеток или животных, например. Таким образом, МТТ является мощным алгоритм слежения, что находит применение в молекулярной и клеточной масштабах.
Protocol
В этом видео мы представляем полный одном эксперименте отслеживания частиц, с помощью квантовых точек, ориентированных на конкретные рецепторы мембраны. Основная цель этого эксперимента заключается в дискриминационной различных типов молекулярных поведения диффузии измеряли в плазме мембраны живых клеток. Более того, молекулярные движения, возникающие на мембране как правило, может отличаться от броуновской диффузии, будучи линейно направленный или заключены в нанодоменов 26-29, например. Мы стремимся одновременно как после многих рецепторов, технически это возможно, дают представление о многообразии возникающих в динамике происходящих в мембране живой клетки. Это в конечном счете, как ожидается, позволит расшифровке механизмов регуляции клеточной сигнализации поверхностных рецепторов.
1. Культуре клеток
- Подготовка сотовой пример: использование сторонник COS-7 клетках, которые эндогенно выражают рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) 30. Когдаработа с живыми клетками без антибиотиков убедитесь, что не скрытая под обнаружению загрязнений с помощью соответствующих методов стерильной в течение всего времени приготовления.
- Рост клеток в полной среде (DMEM с 10% телячьей сыворотки, 1% глутамина, 1% HEPES и 1% пируват натрия, см. таблицу специфических реагентов ниже), при 37 ° C с 7% CO 2, заботясь, чтобы иметь их в суб-вырожденная, экспоненциальный рост до распространения их в Lab-Tek.
- За день до эксперимента, распространился 5000 клеток / лунку в 8-и камер (Lab-Tek) и инкубировать в течение ночи. Подсчет клеток обеспечивает постоянную плотность клеток, следовательно, воспроизводимые отношения квантовых точек на камеру.
2. Сотовые маркировки
Подготовить квантовых точек с определенным покрытием. Квантовой точки являются люминесцентные наночастицы, состоящие из полупроводников. Эти наночастицы представляют большой интерес, потому что они очень яркие и photostable по сравнению с классическимифлуоресцентных зондов 31,32, что позволяет достижение соответствующего сигнала к шуму (SNR) для одного изображения молекулы.
- Перед проведением эксперимента, производят Fab фрагментов против EGFR из гибридомной клеточной линии (МКА 108, ATCC HB-9764), при переваривании папаин, как описано выше 21.
- Сопряженное Fab с биотином, в соответствии с инструкциями изготовителя (EZ-ссылка сульфо-NHS-LC-биотинилирование Kit; Thermo Scientific, рис 1а.).
- Использование квантовых точек с функциональными стрептавидина (Invitrogen) и излучающие на 605 нм (оптимальная длина волны излучения для блеска, обнаружения и отделения от сотовой флуоресценции).
- Подготовка маркировки решение в полной среде (см. таблицу конкретных реагентов) для того, чтобы насытить streptavidins настоящее время около квантовых точек, а также для предотвращения агрегации и неспецифического связывания с клетками и покровного стекла.
- Приготовьте два промежуточных решений:один с квантовыми точками, стрептавидином, а другой с биотинилированного Fab, каждый на 20 нм.
- Смешайте равные объемы этих двух решений: смешать квантовых точек с Fab в соотношении 1:1 для получения окончательного рабочего концентрации 10 нМ Fab: квантово-точек комплекса. Использование эквимолярном соотношении способствует образованию моно-функциональными комплексами состоит из одной квантовой точки и одна биотинилированного фрагмент Fab. Это способствует моновалентной маркировки, ограничивая артефактом наблюдений в связи с рецептором сшивания 33,34.
- Инкубировать 15 минут при 25 ° C, используя шейкер в 1200 оборотов в минуту для предотвращения агрегации. Смесь тогда готова к использованию на живые клетки.
- Инкубируйте клеток в 100 мкл смеси в течение 5 минут при 37 ° C с 7% CO 2.
- Промойте клетки с неправительственными организациями, autofluorescent изображений среды (HBSS буфера, 1% HEPES, см. таблицу специфических реагентов) предварительно нагревают при 37 ° C.
- Аккуратно удалите излишки этикеток для предотвращения ООНнеобходимости портить SNR по несвязанным, в фокусе квантовых точек, по широко стиральная каждую лунку с изображениями среднего, как правило, в 5 раз при комнатной температуре, по крайней мере 5 минут задержки до последнего ополаскивания.
3. Оптическая установка
Видео-микроскопия установка состоит из четырех основных частей:
- Инвертированный микроскоп с определенной флуоресценции куба (FF01-457/50 возбуждения, FF495-Di02 дихроичных и FF01-617/73 фильтры излучения, Semrock) и высокой числовой апертурой (1.3 или 1.49) нефти погружения 100x цели.
- 100 Вт ртутной лампы (в сочетании с микроскопом через оптическое волокно, избегая вмешательства в терморегуляции).
- 512 х 512 пикселей Высокая чувствительность камеры EMCCD для достижения достаточной SNR.
- Инкубатор держать биологических образцов при температуре 37 ° С в течение эксперимента.
4. Приобретение
- Выберите изолированных и хорошо распространение клеток. Этоспособствует расширению красиво, плоский lamellipodia, лучше всего приспособлены для поиска плоского движения мембраны молекул.
- Оцените сотовой физиологического состояния его появление как в проходящем свете и флуоресценции: интенсивный трафик везикулярное, отсутствие некротических или апоптотических признаков, низкий флуоресценции, а средний-сильный квантовых точек маркировки (как правило, до 1000 квантовых точек в ячейке см. Рис. 1B, C).
- Выберите высокой плотности маркировки, которая имеет решающее значение для одновременного мониторинга, как много рецепторов, насколько возможно. Это на самом деле ограничивается как физиологические (поверхностное выражение, эпитоп доступности, боковое движение) и алгоритмических параметров (неперекрывающихся точки распространения функций (НПФ), даже с учетом размытия в связи с движением, для обеспечения надлежащего выявления и повторного).
- Для каждой ячейки, сначала получить изображение светлого поля (предпочтительно использование ДВС, если таковые имеются), которые могут в дальнейшем позволит проверки клетки аспекти пространственные пределы lamellipodia.
- Сохраните это изображение с тем же именем, как видео-стека (например, cell1.tif и cell1.stk например), в суб-папку DIC, так как с этими конвенциями, алгоритм может автоматически находить назад соответствующий образ для каждый стек.
- Получить от 1 до 3 видео в камере, постоянно, как правило, на 36 мс Скорость, достижимая быстрыми темпами в полном кадре с помощью этой камеры. Однако можно приобрести на более высоких частотах, вплоть до 1 мс Скорость, с помощью специальных ПЗС-матрица с повышенной чувствительностью и / или менее пикселей. Кадр передачи технологий обеспечивает незначительной задержкой между кадрами.
- Электронная многократно повышение всегда должно быть установлено на максимум (чуть ниже насыщения, если необходимо), чтобы достижение одной молекулы чувствительности, с достаточным SNR, по крайней мере выше 20 дБ (пик для эффективного обнаружения 1), как правило, около 25-30 дБ.
- Обычно приобретение 300 кадров в видео, грехсе траектории реконструировано более ~ 100 кадров в среднем, в основном ограничиваются долго мигает событий. Частота видео и длина могут быть адаптированы для данной меры, которые могут потребовать больше следов, например.
5. МТТ анализ
- Выберите путь к каталогу, содержащему видео-файлы для оценки данного набора данных с Matlab или октавы.
- Для начала полностью автоматизирован анализ 1,35, введите команду detect_reconnex23 в октаву, или MTT23i в Matlab. Эта программа выступает за "версии 2.3, с пользовательским интерфейсом" и доступен для скачивания вместе с предыдущей версией 2.2. Сначала он отображает графический интерфейс перечислены все параметры, используемые, как показано на рис. 2.
6. Представитель Результаты
МТТ автоматически анализирует каждый видеомагнитофон, чтобы доставить следы обнаружены и оценка целей, дополняется в дальнейшемваний, таких, как лишение свободы обнаружения. В конечном итоге это позволяет отображение следов на ячейки изображения (рис. 1С и 3).
МТТ Описание
Анализ основных МТТ ведется по каждому кадру, ссылаясь на 3 основных задач (рис. 3):
- Обнаружение наличия или отсутствия цели (квантовых точек), в скользящей субрегиона последовательно вокруг каждого пиксела, где две гипотезы сравниваются: наличие любого из сигналов, с PSF modelized как двумерного гауссовского пика , или только шума, используя порог страхования достаточно низкой ложной тревоги, с менее чем одной ложные обнаружения в кадре. Это приводит к карте вероятность обнаружения. Каждый локальный максимум считается предполагаемым цели, гарантируя, что его вероятность на уровне выше минимального значения, устанавливается в соответствии с желаемой вероятность ложной тревоги (PFA). Этот предел установлен достаточно низко, чтобы эффективно различать сигналсигналы от шума, не допуская в лучшем случае ложных обнаружений (PFA 10 -6 по умолчанию, чтобы обеспечить менее одной ошибки в 512 х 512 пикселей изображения), в то же время позволяет достаточно высокой вероятности обнаружения, достигая оптимального теоретически предсказан 1. Отметим, что требование об использовании суб-региона следует, что образ границы (3 пикселей, по умолчанию окна 7 х 7 пикселей) не может быть оценена.
- Оценка для каждой обнаруженной цели, соответствующие параметрам, таким как суб-пикселей положение и интенсивность сигнала. Для каждой обнаруженной цели, наименьших квадратов Гаусса-Ньютона подгонка следующий осуществляется оценить положение, ширина и высота обнаружены Гаусса. Это обеспечивает особенно субпиксельной положение краситель (от 10 до 20 нм, точность типичные значения SNR и неподвижными или медленно диффундирующих красителей, увеличивается до ~ 100 нм для красителей распространении на 0,1 мкм 2 / с).
- Повторное подключение новых задач сСледы уже построено за предыдущие кадры. Набор новых задач сочетается с множеством предыдущих следов. Для этого, для того, чтобы присвоить каждой цели в след, если это возможно, все имеющиеся статистические сведения, полученные от обнаружения шаг используется не только положение, но и интенсивность, ширина мигать и связанные с ними статистики. Таким образом, цели не только назначен в ближайшее следа: в случае пересечения следов, интенсивность, скорость, ширина и мигать будут рассматриваться. Это обеспечивает статистически оптимального повторного счета. Эта стратегия позволяет избежать, по возможности, смещение переподключение к ближайшим соседям.
Обнаружены пики может быть отказано, если апостериорная их оценки или переподключения не удается. Специальный тест обрабатывает обнаружение новых вершин, которая будет инициировать новые следы. Этот тест использует более жесткие PFA (10 -7), с повторным пик след может быть интерпретирован как де-факто о проверке е своей актуальности (этот критерий будучи по определению не распространяется на новые вершины).
Анализ траектории
Возможны переходные удержания следующий оценивается функция обратной зависимости от местных диффузии 24-29. Применение порога позволяет определить ограничивается или нет эпизодов. Повторяя эти за все следы, мы можем отобразить мембраны динамика, в условиях переходного заключения / замедлить события. Это может быть альтернативно представлен либо с помощью двоичного или дискретные значения этого индекса заключения.
По умолчанию, МТТ автоматически выполняет эти задачи, экономя 8 пик параметры в текстовом файле: номер кадра, я и у позиции, интенсивность сигнала, радиус, смещение и мигать, для каждого кадра (группа из 7 строк) и микроэлементов (колонки) . Эти выходные параметры могут быть перегружены в Matlab или Октава использованием fread_data_spt сценарий для дальнейшего анализа, т.е. следов или интенсивность сигнала, как это видно на примере "Http://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt"> MTT_example скрипт в приложении.
Дальнейший анализ приводит к карте следы на каждой ячейки (рис. 1С и 3) и обеспечить гистограммы распределения соответствующих параметров (таких, как пик интенсивности, SNR или местного значения диффузии). Для каждого файла, среднее и стандартное отклонение каждого параметра сохраняются в текстовом файле вместе с изображением гистограммы. Логарифмические распределения, например, для смещений R 2, приводят к средним геометрическим. Коэффициент диффузии вычисляется линейная аппроксимация за первые пять точек MSD кривой. Эти значения обеспечивают обзор эксперимент с участием, например, кинетика клеточных реакций или фармацевтическое / ферментативную лечения, влияющие мембраны организации. С МТТ является открытым исходным кодом, этот аспект может быть легко адаптирована к любой выделенной расследование.
599fig1.jpg "ALT =" Рисунок 1 "/>
Рисунок 1. Мониторинг динамики мембранных рецепторов с помощью МТТ. (А), мембранные компоненты, такие как EGFR, помеченные квантовыми точками связаны с биотинилированного фрагменты Fab (схематическое изображение с правильной примерно масштабирование каждой молекулы). (B) Типичная флуоресцентное изображение приобрело от живого COS-7 клетки, с 36-мс время экспозиции, изображающие дифракционной пиков, соответствующих индивидуально помечены рецепторов. (C) Выход МТТ анализ отображает восстановленные траектории рецепторов, накладывается на светлое изображение клетки.
Рисунок 2. МТТ входных параметров. Запуск MTT23i открывает графический интерфейс пользователя список всех входных параметров, имена и значения по умолчанию, как описано в нашей предыдущей публикации 1. В алгоритме, пространства и времени параметры (поиск окна, пик радиус, максимальная диффузия и мигающий) в безразмерных условных единицах, пикселей и кадры. Калибровка может быть применен для преобразования апостериорных вывода результатов. Значения по умолчанию, что соответствует Каскад 512BFT с 100х увеличением, имеют размер пикселя: 156 нм / пксл и рама задержки: 36 мс / кадр.
Следователи должны оптимизировать несколько важных параметров, таких, как ожидается максимальный коэффициент диффузии ("Разница Макс") и максимальной мигает исчезновения ("T с"). Эти два места и сроки, практически единственные, которые должны быть пересмотрены для данного экспериментальных условиях, другие создаются для надежного значения по умолчанию. Например, число ложных срабатываний напрямую установить для обеспечения менее чем за одну ошибку на миллион пикселей, следовательно, менее одного кадра, который является удовлетворительным для большинства случаев. Все параметры сохраняются в текстовый файл в папку вывода, что позволяет пользователям проверить после настройки, которые были использованы для анализа.
s/ftp_upload/3599/3599fig3.jpg "ALT =" 3 "/>
Рисунок 3. Основные этапы анализа МТТ. Начиная с экспериментальными стек флуоресцентных изображений, пики последовательно и автоматически, по оценкам подходит гауссовой и подключение на кадрах (первый круг операций, верхняя часть блок-схемы). Следы могут быть дополнительно проанализированы на предполагаемых родов, например, в конечном счете приводит к динамической карты соответствующих дескрипторов (второй круг операций, нижняя часть).
Рисунок 4. Маркировка валентность не влияет на МТТ. Для оценки возможного смещения введен артефактного поливалентных маркировки, МТТ анализ был проведен для отслеживания эндогенных EGFR помеченный с помощью 2 различные схемы, создавать и анализировать карты траекторий. (A) рецепторы были помечены биотинилированного Fab и квантово-dots605-стрептавидин, как описано в протоколе.В этом случае несколько валентность квантовых точек и streptavidins может привести к связи несколько рецепторов к одному красителя. (B) рецепторы были помечены Fab непосредственно связан с органическим красителем, Atto647N. В этом случае, один Fab, следовательно, одного рецептора, может быть связана с более чем одной краской. (C) Средний квадрат смещения (MSD) кривая вычислена для всех следов для каждой ячейки, обозначенные как с квантовыми точками или Атто красителей (левый и правый графики, соответственно). Коэффициенты диффузии были вычислены линейные подходит на первых пяти точках MSD (красная пунктирная линия). Каждая схема маркировки привели к аналогичным значениям диффузии (центральный график). Qdot: квантово-dots605 (п = 5 клеток), Атто: Atto647N (п = 7 клеток), нс: не имеет значения (Т-критерий Стьюдента значение р> 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В одночастичной слежения, рядом с клеткой и микроскопии аспекты, анализ представляет собой значительную часть работы. Это решает алгоритм, используемый для выполнения трех основных задач: выявление, оценка и снова пики над каждым кадром. Но последующее аспектом этой работы заключается в разработке алгоритма себя, что, возможно, придется адаптироваться к любой новой выделенной расследования, в основном для последнего, дополнительные меры (например, расшифровка режимов движения, взаимодействия или стехиометрии).
Однако, как только алгоритм полностью разработан, работает она очень просто, тем более что мы обратили внимание на сохранение количества входных параметров при минимальной (рис. 3). Это делает МТТ очень надежный и простой в реализации. При разработке МТТ, мы стремились полностью пересмотреть аналитических параметров, используемых для каждой задачи. Мы хотели, чтобы оптимизировать процесс по двум сложным направлениям:
- Работа умач высокой плотности маркировки предоставляет детальную пространственную информацию в срок выборки ячейки поверхности. В идеале, можно было бы попытаться следовать почти полной молекулярной населения одновременно, для того, чтобы получить полное наблюдение. Тем не менее, такой исчерпывающий маркировки приведет к изображение, похожее на том, что классически получить иммунофлюоресценции, без единой молекулы разрешение, так как все этикетки сильно перекрываются из-за дифракции. Для типичной молекулярной номер (~ 10 5 рецепторов клетки 30) и размер ячейки (т.е. ~ 30 мкм), если считать однородным распределением, среднее между молекулой расстояние ~ 100 нм. Диффузии при приобретении также способствует распространению PSF в сопоставимой степени: обычно ~ 100 нм для броуновского движения в 0,1 мкм 2 / с в течение 30 мс. Примечательно, что это распространяется изотропно в среднем и, следовательно, порождает еще гауссова типа PSF. Таким образом, до 10% населения может быть теоретически обнаружено, так как это лугг в среднем расстоянии ~ 300 нм, совместимый с дифракции и движение границ. Тем не менее, это должен быть модулированный учета неоднородности пространственного распределения, маркировка ограничения (например, стерических ограничений, эпитоп доступность и т.д.), увеличивая и даже неразрешимые конфликты, связанные с пересечением траектории, и общая эффективность обнаружения. В эксперименте, мы могли бы достичь и точно контролировать значительную долю от общей численности населения, с плотностью ~ 1000 метками в поле зрения шириной 80 мкм. Этот верхний предел результатов от компромисса между необходимостью индивидуального обнаружения и цель исчерпывающего пространственных измерений (см. рис. 1С оценить пространственный отбор проб на поверхности клеток).
- Работа с возможно более слабых SNR позволяет изображений или при низкой освещенности, который является полезным для жизнеспособность клеток и / или с высокой скоростью, что обеспечивает лучшую временную информацию. Тем не менее, это означает более низкий сигналв изображении, в связи со снижением количества собранных фотонов. Обратите внимание, что кратчайший сроки достижимыми на EMCCD камеры (1 мс), как представляется, соответствуют самым низким приемлемый SNR (20 дБ) для правильного обнаружения и оценки с помощью МТТ.
Маркировка валентность является постоянной проблемой в одной исследования молекулы. Действительно, прямое измерение красителя / мишень отношение очень сложные 34. Тем не менее, альтернативный способ исследования предполагаемого смещения введен артефактного поливалентных маркировки состоит в сравнении с мерами или квантовых точек тэги (предположительно с нескольких целей в красителя, вызывая артефактного сшивание) или органического красителя тэги (с, по крайней наоборот, предположительно несколько красителей на цели, смещения только интенсивность сигнала и отбеливающие характеристики). Мы и другие 6,36,37 наблюдали сопоставимых поведения при использовании любой квантовой точки или органических красителей (atto647N в нашем случае рис. 4), с точки зрения распространения и перехода от моментаде движения. Изменение значения диффузии между двумя условиями ниже, чем клетки к клетке неравенство (рис. 4в). Это показывает, что маркировка валентности, даже если они не строго моновалентная, не оказывает существенного влияния SPT результаты.
Удержание и молекулярных взаимодействий
Переходные и устойчивое удержание может быть интерпретировано как подпись льготных близость или взаимодействие 24-29. Биомембран действительно сильно неоднородной, с местной сборки продиктована структурными функциями, такими как гидрофобность, трансмембранный размера и поверхностного натяжения. Эти движущие силы приводят к пространственно-временной реконструкции функциональных узлов с критической роли, т.е. сигнализации, сцепление или торговлей людьми. Отображение и количественной оценки таких событий, как ожидается, дают ключ к расшифровке как ячейка объединяет непрерывно представлена раздражители. Действительно, клетки, демонстрируя адекватной адаптации через точный ответ REQUires настройки взаимодействия между сигнализации партнеров и их окружения. Мембранные рецепторы могут взаимодействовать как с суб-мембраны цитоскелета заборы, мембранные структуры, такие как endocytic ямы или координационных спаек, или также белковые / липид партнеров, участвующих в передаче сигналов областях, например. В нашем представлении, такие события могут быть исследованы с помощью силы удержания и ее изменения во времени и пространстве. Это еще больше усиливает важность работы на самом высоком достижимой пространственно-временного разрешения, с учетом ограничений, связанных с короткими таймингами и высокой плотностью, о чем говорилось выше.
Дополнительные методы
Это хорошая практика, чтобы сравнить такие динамических измерений с другими подходами. Например, другие динамические методы микроскопии, как FRAP и ФТС, обеспечить дополнительную чувствительность и разрешение 4,38,39. FRAP обеспечивает ансамбль измерения молекулярной диффузии, а ФТС может достичь сИнгл молекулы чувствительности, с очень хорошим временным разрешением. Тем не менее, оба метода по сути ограничивается локальной меры (обычно в течение конфокальной месте). Это побудило нас воспользоваться и выйти за пределы пространственных возможностей SPT: исследование большого поля зрения, чтобы охватить всю ячейку сразу, вместе с соответствующими локально пространственно-временной точностью.
Дальнейшее развитие и исследования
По данным ряда биологических вопросов, которые могут решить с помощью одной молекулы измерений, МТТ может быть продлен по различным направлениям, на каждом уровне: выявление, оценка, повторного и последующего анализа. Например, можно рассмотреть дело с более чем одной молекулярной населения, призывая к обнаружению многоцветный - как можно выполнить с помощью посвященной оптическим или аналитических схем. Оценка может включать в себя новый соответствующих дескрипторов, таких, как любой спектральной поляризации или информации, или осевойг положении, для расширения трассировки в 3D 40.
Для повторного подключения, броуновское и мигает предположения могут быть полностью пересмотрен для конкретной задачи. Любопытно, что одной молекулы измерения были расширены за последние десятилетия так называемого режима наноскопических 17,22,23. Несмотря на то, МТТ непосредственно решении одной молекулы локализации, она имеет решающее значение для рассмотрения дела из установленного образца, которая обеспечивает безопасное решение для исчерпывающего локализации молекулярных населения. Однако в таком случае броуновского предположение отпадает. Замена его точно обработки наноскопических мере, ограничено только SNR, имеет решающее значение для достижения лучших нанометровом разрешении.
Помимо такого развития событий, на основе либо многоцветной, 3D и / или исчерпывающие меры, будущей работы как ожидается, обеспечит полное представление о молекулярной статические и динамические данные. Это будет иметь прямые relevоб учете клеточной биологии исследований, таких как расшифровка тонких форм дополнительного регулирующего и внутриклеточной сигнализации.
Загрузка МТТ
Исходный код МТТ доступен как с открытым исходным кодом программное обеспечение для научных исследований. Его можно загрузить с нашего веб-страницы, на ciml.univ-mrs.fr , путем перехода на страницу нашей команды, он и Marguet Lab, которая содержит ссылку на описание программного обеспечения и загрузки. Обратите внимание, что мы просим Вас указать Ваше имя и учреждение только для информации, например, в случае дальнейшего сотрудничества или сообщить Вам о новой версии или обновления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим членов нашей команды, в частности, MC Блаш для оказания технической помощи, а также M Irla и B Imhof, за их поддержку и плодотворные обсуждения. Данные по дефляции и удержания воспроизводится любезность природы методы. Проект осуществляется при поддержке институциональных грантов из CNRS, INSERM и Марсель университета, а также конкретных грантов из региона Прованс-Альпы-Кот-d'Azur, Национальный институт рака дю, Agence Nationale-де-ла Recherche (ANR-08-PCVI- 0034-02, 2010 ANR Блан 1214 01) и Фонд застывания La Recherche Medicale (Equipe labélisée FRM-2009). ВР поддерживает общение с Ligue Nationale Рак Contre ле.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cos-7 cell line | ATCC | CRL-1651 | 5,000 cells/well |
| HBSS without Ca2+ | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | 1 ml |
| 0.05% Trypsin EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 1 ml |
| 8-well Lab-tek | Nalge Nunc international | 155441 | 1 |
| QDot-605 streptavidin | Invitrogen | Q10101MP | 20 mM |
| Biotinylated Fab (for Fab synthesis, see reference 21) | |||
| Fab from mAb 108 | ATCC | HB-9764 | 200 μg |
| NHS-Biotin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21435 | 18.5 μg |
| Complete medium | |||
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 41965 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | 50 ml |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | 5 ml |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | 5 ml |
| Sodium Pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360 | 5 ml |
| Imaging medium | |||
| HBSS with Ca2+ | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | 25 ml |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | 250 μl |
| Inverted microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE2000U | |
| Fluorescent lamp | Nikon Instruments | Intensilight C-HGFIE | |
| 1.3 NA 100x objective | Nikon Instruments | Plan Fluor 1.30 | |
| 1.49 NA 100x objective | Nikon Instruments | APO TIRF 1.49 | |
| Camera | Roper Scientific | Cascade 512 B | |
| Thermostated box | Life Imaging Services | The Box | |
| Appendix: example Script of MTT supplementary analysis | |||
| function MTT_example(file_name) %%% Basic examples showing how to recover MTT output results %%% to plot each trace and to build the histogram %%% of fluorescence intensities |
|||
| if nargin<1 % no file_name provided? files = dir('*.stk'); if isempty(files), disp('no data in current dir'), return, end file_name = files(1).name; % default: first stk file disp(['using' file_name 'by default']) end |
|||
| file_param = [file_name '_tab_param.dat']; % output file | |||
| %% Load data cd('output23') % or (‘output22'), according to version used % Disclaimer: version 2.2 only generates 7 parameters, % an extra parameter, noise, was added in version 2.3 |
|||
| % To read all parameters at once, in a single table % tab_param = fread_all_param(file_param); % tab_i = tab_param(2:8:end, :); tab_j = ... |
|||
| % To read all parameters (except frame_number) in separate tables % [tab_i,tab_j,tab_alpha,tab_radius,tab_offset,tab_blk,tab_noise] = fread_all_data_spt(file_param); |
|||
| tab_i = fread_data_spt(file_param, 3); % index is 3 because trace number & frame number, non informative, are discarded! tab_j= fread_data_spt(file_param, 4); tab_alpha = fread_data_spt(file_param, 5); tab_blk = fread_data_spt(file_param, 8); |
|||
| %% Loop over traces N_traces = size(tab_i,1); % Tables are N_traces lines by N_frames colums |
|||
| for itrc = 1:N_traces No_blk_index = tab_blk(itrc, :)>0; % non blinking steps only plot(tab_i(itrc, No_blk_index), tab_j(itrc, No_blk_index)) xlabel('i (pixel)'), ylabel('j (pixel)') title(['trace # ' num2str(itrc)]) disp('Please strike any key for next trace'), pause end |
|||
| %% Fluo histogram N_datapoints = sum(tab_blk(:)>0); % non blinking steps only hist(tab_alpha(tab_blk>0),2*sqrt(N_datapoints)) % using 2sqrt(N) bins xlabel('intensity (a.u.)'), ylabel('occurrence') title('histogram of particles fluorescence intensity') |
|||
References
- Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat. Methods. 5, 687-694 (2008).
- Schmidt, T., Schutz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H.
- Lommerse, P. H. Single-molecule imaging of the H-ras membrane-anchor reveals domains in the cytoplasmic leaflet of the cell membrane. Biophys. J. 86, 609-616 (2004).
- Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order. EMBO. J. 25, 3446-3457 (2006).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: applications to membrane dynamics. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 373-399 (1997).
- Dahan, M. Diffusion dynamics of glycine receptors revealed by single-quantum dot tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
- Harms, G. S. Single-molecule imaging of l-type Ca(2+) channels in live cells. Biophys. J. 81, 2639-2646 (2001).
- Iino, R., Koyama, I., Kusumi, A. Single molecule imaging of green fluorescent proteins in living cells: E-cadherin forms oligomers on the free cell surface. Biophys. J. 80, 2667-2677 (2001).
- Sako, Y., Minoghchi, S., Yanagida, T. Single-molecule imaging of EGFR signalling on the surface of living cells. Nat. Cell Biol. 2, 168-172 (2000).
- Schutz, G. J., Kada, G., Pastushenko, V. P., Schindler, H. Properties of lipid microdomains in a muscle cell membrane visualized by single molecule microscopy. Embo. J. 19, 892-901 (2000).
- Seisenberger, G. Real-time single-molecule imaging of the infection pathway of an adeno-associated virus. Science. 294, 1929-1932 (2001).
- Jacobson, K., Sheets, E. D., Simson, R. Revisiting the fluid mosaic model of membranes. Science. 268, 1441-1442 (1995).
- Saffman, P. G., Delbruck, M.
- Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
- Papoulis, A. Probability, Random Variables and Stochastic Process 277. , McGraw Hill. (2001).
- Van Trees, H. L. Detection, Estimation, and Modulation Theory, Wiley Inter-Science. , (1968).
- Moerner, W. E. Single-molecule mountains yield nanoscale cell images. Nat. Methods. 3, 781-782 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).
- Betzig, E. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Manley, S. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).
- Andrew, S. M.
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt. Lett. 19, 780-782 (1994).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt. Lett. 24, 954-956 (1999).
- Meilhac, N., Guyader, L. L. e, Salome, L., Destainville, N. Detection of confinement and jumps in single-molecule membrane trajectories. Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft. Matter Phys. 73, 011915 (2006).
- Saxton, M. J.
- Serge, A., Fourgeaud, L., Hemar, A., Choquet, D. Receptor activation and homer differentially control the lateral mobility of metabotropic glutamate receptor 5 in the neuronal membrane. J. Neurosci. 22, 3910-3920 (2002).
- Simson, R., Sheets, E. D., Jacobson, K. Detection of temporary lateral confinement of membrane proteins using single-particle tracking analysis. Biophys. J. 69, 989-993 (1995).
- Jacobson, K., Dietrich, C.
- Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophys. J. 65, 2021-2040 (1993).
- Livneh, E. Large deletions in the cytoplasmic kinase domain of the epidermal growth factor receptor do not affect its laternal mobility. J. Cell Biol. 103, 327-331 (1986).
- Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and. 4, 435-446 (2005).
- Wu, X., Bruchez, M. P. Labeling cellular targets with semiconductor quantum dot conjugates. Methods Cell Biol. 75, 171-183 (2004).
- Mohammadi, M. Aggregation-induced activation of the epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase. Biochemistry. 32, 8742-8748 (1993).
- Howarth, M. Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells. Nat. Methods. 5, 397-399 (2008).
- Bertaux, N., Marguet, D., Rigneault, H., Sergé, A. Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface. Protocol Exchange. , (1038).
- Groc, L. Surface trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 12433-12437 (2007).
- Cui, B. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
- He, H. T., Marguet, D. Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 417-436 (2011).
- Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles. J. Cell. Sci. 123, 309-320 (2010).
- Kao, H. P., Verkman, A. S. Tracking of single fluorescent particles in three dimensions: use of cylindrical optics to encode particle position. Biophys. J. 67, 1291-1300 (1994).
