Method Article

Mapping molekulare Diffusion in der Plasmamembran durch Multiple-Target Tracing (MTT)

DOI:

10.3791/3599

⸱

May 27th, 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, UMR 631, Parc scientifique de Luminy, 2Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 6102, Parc scientifique de Luminy, 3Centre d'Immunologie de Marseille-Luminy, Aix-Marseille University, 4École Centrale Marseille, Technopôle de Château-Gombert, 5Institut Fresnel, Aix-Marseille University, 6Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 6133, Aix-Marseille University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multiple-Target-Tracing ist ein Algorithmus für die Verfolgung von hausgemachten individuell markierten Moleküle in der Plasmamembran von lebenden Zellen entwickelt. Effiziente Erfassung, Abschätzung und Tracing-Moleküle im Laufe der Zeit bei hoher Dichte bieten eine benutzerfreundliche, umfassende Werkzeug, um nanoskalige Membran Dynamik zu untersuchen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Unser Ziel ist eine umfassende Beschreibung der molekularen Vorgänge bei zellulären Membranen in verschiedenen biologischen Funktionen zu erhalten. Unser Ziel ist die Charakterisierung der komplexen Organisation und Dynamik der Plasmamembran auf Einzel-Molekül-Ebene, durch die Entwicklung von Analysewerkzeugen gewidmet Single-Particle Tracking (SPT) in hoher Dichte: Multiple-Target Tracing (MTT) 1. Einzel-Molekül-Videomikroskopie und bietet Millisekunde und Auflösung im Nanometerbereich 1-11, erlaubt eine detaillierte Darstellung der Membran Organisation von 12-14 genau Mapping-Deskriptoren wie Zell-Rezeptoren-Lokalisierung, Mobilität, Gefangenschaft oder Wechselwirkungen.

Wir revisited SPT, sowohl experimentell als auch algorithmisch. Experimentelle Aspekte waren die Optimierung Setup-und Zell-Kennzeichnung, mit besonderem Schwerpunkt auf dem Erreichen der höchstmöglichen Dichte Kennzeichnung, um eine dynamische Momentaufnahme der Molekulardynamik einen gebens tritt es innerhalb der Membran. Algorithmische Fragen betroffenen einzelnen Schritte für den Wiederaufbau von Flugbahnen verwendet: Spitzen-Erkennung, Einschätzung und der Wiederanschluss von speziellen Werkzeugen aus Bildanalyse 15,16 gerichtet. Implementieren von Deflation nach Entdeckung ermöglicht Rettung Gipfel zunächst von benachbarten, stärkeren Peaks versteckt. Zu beachten ist, wirkt sich direkt auf die Verbesserung der Erkennung Wiederverbindung, durch Reduzierung der Lücken innerhalb Flugbahnen. Vorstellungen wurden ausgewertet mit Hilfe von Monte-Carlo-Simulationen für unterschiedliche Kennzeichnung Dichte und Noise-Werte, die in der Regel stellen die beiden wesentlichen Einschränkungen für parallele Messungen bei hoher örtlicher und zeitlicher Auflösung.

Die Nanometergenauigkeit 17 für einzelne Moleküle erhalten, unter Verwendung von entweder aufeinanderfolgenden Ein / Aus Photoschalten oder der nichtlinearen Optik, liefern kann, flächendeckende Betrachtungen. Dies ist die Grundlage von Nanoskopiemethoden 17 wie Sturm 18, PALM 19,20, 21 oder RESOLFT STED 22,23, which erfordert häufig den Imaging-fixierten Proben. Die zentrale Aufgabe ist die Erkennung und Einschätzung der beugungsbegrenzten Spitzen ausgehend von Single-Moleküle. Daher angemessene Annahmen wie z. B. Umgang mit einer konstanten Positionsgenauigkeit anstelle der Brownschen Bewegung, wird MTT unkompliziert für nanoskopische Analysen geeignet. Ferner kann MTT grundsätzlich in jedem Maßstab verwendet werden: nicht nur für Moleküle, sondern auch für Zellen oder Tiere, zum Beispiel. Daher ist ein leistungsfähiges MTT-Tracking-Algorithmus, der Anwendungen findet auf molekularer und zellulärer Skalen.

Protocol

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In diesem Video stellen wir eine vollständige Single Particle Tracking Experiment, mit Hilfe von Quanten-Dots gezielt an eine bestimmte Membran-Rezeptor. Das Hauptziel dieser Versuch besteht darin, diskriminierende verschiedene molekulare Diffusion Verhalten in der Plasmamembran von lebenden Zellen gemessen. Tatsächlich können molekulare Bewegungen, die durch an der Membran typischerweise Brownsche Diffusion abweichen, die linear gerichteten oder geschlossenen in Nanodomänen 26-29, zum Beispiel. Wir zielen darauf ab, gleichzeitig nach so vielen Rezeptoren wie technisch möglich, um einen Schnappschuss von der Vielfalt, die sich in der Dynamik, die innerhalb....

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Discussion

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In Einzelpartikel-Tracking, neben den Zellen und Mikroskopie Aspekte stellt die Analyse einen wesentlichen Teil der Arbeit. Diese befasst sich mit der Algorithmus verwendet, um die drei wichtigsten Aufgaben: Erkennen, Abschätzen und wieder Gipfeln über jeden Frame. Aber die konsequente Aspekt dieser Arbeit besteht in der Erarbeitung des Algorithmus selbst, die müssen für jede neue dedizierte Untersuchung, im Wesentlichen für den letzten, zusätzliche Schritte (wie Entschlüsselung Arten der Bewegung, Interaktionen oder St.......

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Disclosures

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgements

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Wir bedanken uns bei Mitgliedern unseres Teams, vor allem MC Blache für technische Unterstützung, sowie M-und B-Irla Imhof, für ihre Unterstützung und fruchtbare Diskussionen. Zahlen für Deflation und Entbindung reproduziert mit freundlicher Genehmigung von Nature Methods. Dieses Projekt wird von institutionellen Zuschüssen aus dem CNRS, INSERM und Marseille-Universität, und durch gezielte Zuschüsse aus der Region Provence-Alpes-Côte d'Azur, Institut National du Cancer, Agence Nationale de la Recherche (ANR unterstützt-08-PCVI- 0034-02, ANR 2010 BLAN 1214 01) und der Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe labélisée FRM-2009). VR wird durch ein Stipendium de....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagens Firma Katalog-Nummer Menge
Cos-7-Zelllinie ATCC CRL-1651 5000 Zellen / Well
HBSS ohne Ca 2 + GIBCO 14175 1 ml
0,05% Trypsin-EDTA GIBCO 25300 1 ml
8-Well Lab-Tek NUNC 155441 1
QDot-605 Streptavidin Invitrogen Q10101MP 20 mM
Biotinylierten Fab (Fab für Synthese, siehe Referenz 21)
Fab aus mAb 108 ATCC HB-9764 200 ug
NHS-Biotin Thermo Scientific 21435 18,5 pg
Komplett Medium
DMEM GIBCO 41965 500 ml
Fötalem Rinderserum SIGMA F7524 50 ml
L-Glutamin GIBCO 25030 5 ml
HEPES GIBCO 15630 5 ml
Natriumpyruvat GIBCO 11360 5 ml
Bilderzeugungsmedium
HBSS mit Ca 2 + GIBCO 14025 25 ml
HEPES GIBCO 15630 250 ul

1 "> Ausrüstung Firma Referenz Inverses Mikroskop Nikon Eclipse-TE2000U Leuchtstofflampe Nikon Intensilight C-HGFIE 1,3 NA 100x Objektiv Nikon Plan Fluor 1,30 1,49 NA 100x Objektiv Nikon APO TIRF 1,49 Kamera Roper Scientific Cascade 512 B Thermostatisiert Box Life Imaging Dienstleistungen The Box

Anhang: Auszug aus einem Skript von MTT ergänzende Analyse

Funktion MTT_example (Dateiname)
%%% Basic-Beispiele, die zeigen, wie man MTT Ausgabeergebnisse erholen
%%% Zu plotten jede trace und um das Histogramm zu bauen
%%% Der Fluoreszenzintensitäten

wenn nargin <1% kein file_name zur Verfügung gestellt?
Dateien = dir ('* stk.');
wenn IsEmpty (Dateien), disp ('keine Daten im aktuellen Verzeichnis'), Rückkehr, Ende
. file_name = Dateien (1) Name;% default: stk erste Datei
disp (['mit' datei 'standardmäßig'])
Ende

file_param = [Dateiname '_tab_param.dat'];% Ausgabe-Datei

%% Laden von Daten
cd ("output23 ')% oder (' output22 '), je nach Ausführung verwendet
% Haftungsausschluss: Version 2.2 erzeugt nur 7 Parameter,
% Ein zusätzlicher Parameter, Lärm, wurde in Version 2.3 hinzugefügt

% Um alle Parameter auf einmal zu lesen, in einer einzigen Tabelle
% = Tab_param fread_all_param (file_param);
% Tab_i = tab_param (2:8: end, :); tab_j = ...

% Um alle Parameter (außer frame_number) in separaten Tabellen lesen
% [Tab_i, tab_j, tab_alpha, tab_radius, tab_offset, tab_blk, tab_noise] = fread_all_data_spt (file_param);

tab_i = fread_data_spt (file_param, 3);% Index ist 3, weil Trace-Nummer und Rahmennummer, nicht informativ, verworfen werden!
tab_j = fread_data_spt (file_param, 4);
tab_alpha = fread_data_spt (file_param, 5);
tab_blk = fread_data_spt (file_param, 8);

%% Schleife über Spuren
N_traces = size (tab_i, 1);
% Tabellen sind N_traces Linien durch Spalten N_frames

für ITRC = 1: N_traces
No_blk_index = tab_blk (ITRC, :)> 0;% nicht blinken Schritte nur
Grundstück (tab_i (ITRC, No_blk_index), tab_j (ITRC, No_blk_index))
& Nbsp; xlabel ('i (Pixel)'), ylabel ('J (Pixel)')
title (['trace #' num2str (ITRC)])
disp ('Bitte treffen Sie eine beliebige Taste für die nächste Spur "), Pause
Ende

%% Fluo Histogramm
N_datapoints = SUMME (tab_blk (:)> 0);% nicht blinken Schritte nur
hist (tab_alpha (tab_blk> 0), 2 * sqrt (N_datapoints))% mit 2sqrt (N) Bins
xlabel ('Intensität (au)'), ylabel ("Ereignis")
title ('Histogramm der Partikel Fluoreszenzintensität')

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat. Methods. 5, 687-694 (2008).
  2. Schmidt, T., Schutz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H. Imaging of single molecule diffusio....

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Multiple Target TracingSingle Particle TrackingEpidermal Growth Factor ReceptorQuantum Dot LabelingHigh Density ImagingTrajectory ReconstructionPeak DetectionDeflation AlgorithmTransient Confinement AnalysisMonte Carlo Simulations

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