Die Modell-Organismus C. elegans Verwendet pseudocoelomic Fluid als passives Kreislaufsystems. Direkter Assay dieser Flüssigkeit wurde zuvor nicht möglich. Hier präsentieren wir eine neuartige Technik direkt Assay den extrazellulären Raum, und verwenden systemischen Silencing-Signale während einer RNAi-Antwort als proof of principle Beispiel.
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Methodenartikel
Vampiric Isolation der extrazellulären Flüssigkeit aus
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die genetisch gefügig Modellorganismus C. elegans hat Einblicke in eine Vielzahl von biologischen Fragestellungen vorgesehen, aktiviert durch seine kurze Generationszeit, einfache Wachstum und geringe Größe. Diese geringe Größe, aber hat lehnten eine Reihe von technischen Ansätzen in anderen Modellsystemen gefunden. Zum Beispiel ermöglichen Bluttransfusionen in Säugetier-Systemen und Transplantation Techniken in Anlagen Fragen des Kreislaufsystems Zusammensetzung und Signalisierung. Das Kreislaufsystem der Schnecke, der pseudocoelom, war bis vor kurzem nicht möglich direkt Assay. Um Fragen der interzellulären Signaltransduktion und Kreislaufsystem Zusammensetzung C. beantworten elegans Forscher haben traditionell genetische Analyse, Zelle / Gewebe-spezifische Rettung und Mosaik-Analyse eingeschaltet. Diese Techniken stellen ein Mittel zu folgern, was zwischen Zellen geschieht, sind jedoch nicht universell in Identifizierung und Charakterisierung von extrazellulären Moleküle. Hier präsentieren wir eine neWLY entwickelten Technik direkt Assay die pseudocoelomic Flüssigkeit C. elegans. Die Technik beginnt entweder genetisch oder physikalische Manipulation um das Volumen des extrazellulären Fluids zu erhöhen. Danach werden die Tiere mit einem vampirischen umgekehrter Mikroinjektionstechnik mit einer Mikroinjektion rig, die feine Balance Druckregelung ermöglicht unterzogen. Nach Isolierung der extrazellulären Flüssigkeit, kann die aufgefangene Flüssigkeit durch Überführung in anderen Tieren oder durch molekulare Methoden untersucht werden. Um die Wirksamkeit dieser Technik zu demonstrieren wir eine detaillierte Konzept für Assay ein spezifisches Beispiel der extrazellulären Signalmolekülen, lange dsRNA während einer systemischen RNAi-Antwort. Obwohl Charakterisierung der systemischen RNAi ist ein proof of principle Beispiel sehen wir diese Technik als anpassungsfähig an eine Vielzahl von Fragen des Kreislaufsystems Zusammensetzung und Signalisierung beantworten.
Protokoll
Ein. Herstellung von Materialien
Das Material notwendig vampirischen umgekehrter Mikroinjektion ist ähnlich dem für Standard Mikroinjektion Techniken verwendet, um transgene C. machen erforderlich elegans-Stämme ein. Obwohl einige Reagenzien (z. B. Assay-Platten) hergestellt werden der Tag der experimentellen Übertragung muss viele der Materialien koordinativ über einen 8 Tagen (siehe Tabelle 1 für eine Zeit-Tabelle) hergestellt werden. Als solches ist es wichtig, nach vorne sorgfältig geplant, wenn unter Verwendung dieser Technik (z. notwendigen Reagenzien und Ausrüstung siehe Tabelle 2....
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Diskussion
Wir haben hier ein neuartiges Verfahren, das die Isolierung und Charakterisierung der extrazellulären Flüssigkeit von der ermöglicht Modellorganismus C. vorgestellt elegans. Die Technik beginnt mit der genetischen oder physikalische Manipulation von Spender Würmer ihr Gesamtvolumen der extrazellulären Flüssigkeit zu erhöhen. Extrazellulären Flüssigkeit wird dann isoliert unter Verwendung eines modifizierten Mikroinjektionstechnik. Die Würmer sind für die Mikroinjektion mit trockener Agarose-Pads, um di.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Wir möchten den kooperativen Charakter der Hunter-Labor bestätigen, und danke ihnen für die hilfreiche Diskussionen und Unterstützung, die Entwicklung dieser Technik möglich und Spaß gemacht. Wir möchten Nigel Delaney und Caenorhabditis Genetics Center for Wurm und Bakterienstämme danken. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health GM089795 Zuschuss CPH unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Day Worm Prep Material Prep | |||
| -7 Oder Standes | Pflegen sauber, gut gefüttert Clr-1 (e1745) N2 und Würmern | Make Injektion Pads, NGM-Platten, NGM + Carb / IPTG Platten, OP50 LB Lager | |
| -6 | Streak von RNAi Essen auf LB + Carb | ||
| -5 | Impfen 3 mL Übernachtung mit RNAi Lebensmitteln | ||
| -4 | Bewegen Embryonen RNAi Platte | Seed RNAi Platte | |
| -3 | |||
| -2 | |||
| -1 | |||
| 0 | Umschalttaste Würmern bis 25 für 4 Stunden | Make Testplatten | |
| Bewegen Würmer NGM-Platten reinigen | |||
| Vampiric Transfer | |||
| Wiederherstellen Empfänger | |||
| +1 | Entfernen Übertragungsbehältnis | ||
| +2 | Score Progeny |
Tabelle 1. Material Vorbereitung Timeline.
| Ausrüstung Unternehmen Katalog-Nummer | ||
|---|---|---|
| Picoliter Druck Injector | Warner Instruments | 65-0001 (PLI-100) |
| Flaming / Brown Feinpipettenziehvorrichtung | Sutter Instruments | P97 |
| Axiovert 200 | Zeiss | |
| Reagenzien | ||
| Mineral Oil | EM Science | MX1560-1 |
| 22x50 no 1 ½ Deckglas | Corning | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 |
| Borosilikatglas Kapillaren | World Precisions Instruments | 1B100F-4 |
| Natriumhypochlorit-Lösung (5% verfügbares Chlor) | JT Baker | 9416-01 |
| C. elegans Und Bakterienstämme | ||
| Clr-1 (e1745) II 9 | Die Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | CB3241 |
| GLP-1 RNAi-Vektor 10 | Source Bioscience (Ahringer Feeding Library) | F02A9.6 |
| PAL-1 RNAi-Vektor 11 | PHC187 | |
| OP50-GFP 5 | Die Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50-GFP |
| YFP E. coli 4 | MC4100-YFP |
Tabelle 2. Spezifische Reagenzien und Geräte.
Referenzen
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833-e833 (2008).
- Hirose, T., Nakano, Y., Nagamatsu, Y., Misumi, T., Ohta, H., Ohshima, Y. Cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 con....
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Nachdrucke und Genehmigungen
Tags
Isolierung extrazellulärer FlüssigkeitPseudocoelom von C. elegansvampirische reverse Mikroinjektionsystemischer RNAi-AssayTransfer von dsRNA-SignalenDrucksteuerung bei der MikroinjektionAnalyse der pseudocoelomischen Flüssigkeitphänotypisches RNAi-ScoringFlüssigkeitstransfer bei WürmernVorbereitung von NGM-Platten
