Methodenartikel

Gentransfer an sich entwickelnden Maus Innenohr In Vivo Die Elektroporation

DOI:

10.3791/3653

⸱

30. Juni 2012

 ,  , 
1Oregon Hearing Research Center, Oregon Health & Science University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Maus ist eine Innenohr-derived Plakode Sinnesorgan, dessen Entwicklungs-Programm wird während der Schwangerschaft erarbeitet. Wir definieren ein In der Gebärmutter Gentransfer-Technik, bestehend aus drei Schritten: Maus ventralen Laparotomie, transuterine Mikroinjektion, und In-vivo- Elektroporation. Wir nutzen digitale Video-Mikroskopie, um die kritischen experimentellen embryologischen Techniken zu demonstrieren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Säugetier-Innenohr hat 6 verschiedene Sinnesepithelien: 3 Cristae in den Ampullen der Bogengänge; Maculae im Utriculus und Sacculus, und das Corti-Organ in der Coiled Cochlea. Die Cristae und Maculae enthalten vestibulären Haarzellen, die mechanische Reize, um die besonderen Sinn für Ausgewogenheit dienstbar, während auditiven Haarzellen im Corti-Organ die primären Wandler für Hörgeräte sind ein transduzieren. Zellschicksals Spezifikation in diesen Sinnesepithelien und Morphogenese der Bogengänge und Hörschnecke finden während der zweiten Woche der Schwangerschaft in der Maus und sind weitgehend vor der Geburt 2,3 abgeschlossen. Entwicklungsstudien der Maus Innenohr werden routinemäßig von der Ernte transgenen Embryonen bei unterschiedlichen embryonalen oder postnatalen Stadien, um Einblick in die molekularen Grundlagen der zellulären und / oder morphologische Phänotypen gewinnen 4,5 durchgeführt. Wir vermuten, dass Gen-Transfer in die Entwicklungsländer Maus Innenohr in utero </ Em> im Rahmen der Gewinn-und Verlust-of-function-Studien stellt einen kostenlosen Zugang zur traditionellen Maus-Transgenese für die Abfrage der genetischen Mechanismen, die Säugetier-Innenohr Entwicklung 6.

Das experimentelle Paradigma zur Gen Fehlexpression Studien im sich entwickelnden Maus Innenohr führen demonstriert hier löst sich in drei Schritten: 1) ventrale Laparotomie; 2) transuterine Mikroinjektion, und 3) in vivo Elektroporation. Ventralen Laparotomie ist eine Maus Überleben chirurgische Technik, die Externalisierung der Gebärmutter ermöglicht, experimentelle Zugang zu den implantierten Embryonen 7 zu gewinnen. Transuterine Mikroinjektion ist die Verwendung von abgeschrägten, Glaskapillare Mikropipetten Expressionsplasmid in das Lumen des Ohr-Vesikel oder otocyst einzuführen. In-vivo-Elektroporation die Anwendung von Rechteckwellen, direkte Stromimpulse an Expressionsplasmid in Vorläuferzellen 8-10 anzutreiben.

11. Maus experimentellen embryologischen Techniken kann schwierig sein, von Prosa zu lernen und Standbilder allein. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir, die 3 Schritte in der Gen-Transfer Verfahren. Die meisten kritisch, setzen wir digitale Video-Mikroskopie genau zeigen, wie man: 1) zu identifizieren Embryo Orientierung in utero, 2) neu zu orientieren Embryonen für die gezielte Injektionen an den otocyst; 3) microinject DNA mit Tracer-Farbstoff-Lösung in die otocyst gemischt an embryonalen Tag 11,5 und 12,5; 4) elektroporieren des eingespritzten otocyst und 5) Label elektroporiert Embryonen für postnatale Auswahl bei der Geburt. Wir bieten repräsentative Beispiele von erfolgreich transfizierten Innenohr; eine bildliche Anleitung zu den häufigsten Ursachen von otocyst Misstargeting; diskutieren, wie man gemeinsame methodische Fehler zu vermeiden; und Gegenwart Leitlinien für ein Schreiben in utero gEn-Transfer-Protokoll Tierpflege.

Protokoll

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1. Ventralen Laparotomie

  1. Anesthetize einen Damm, dessen Embryonen sind an embryonalen Tag 11,5 (E11.5; Uhr am Tag ein Vaginalpfropf erkannt wird ist Tag 0,5 der Embryonalentwicklung) durch intraperitoneale Injektion von Natrium-Pentobarbital Narkose-Lösung (7,5 ul pro Gramm Körpergewicht). Arbeiten Anästhesielösung: 180 ul 50 mg / ml Pentobarbital-Natrium-Lösung; 100 L absolutem Ethanol; 320 ul von 65 mg / ml wässrige Magnesiumsulfat (moduliert Uterustonus) und 400 ul Propylenglykol (Fahrzeug mischbar mit wässrigen und organischen Komponenten).
  2. Beurteilen Sie die Vollständigkeit der Narkose durch die Durchführung Schmerzreize Tests: Squeeze Pfote; Schwanz Prise; und Blink-Reaktion auf die Wange und Tasthaare Touch. Bewerben sterile Augensalbe auf die Hornhaut.
  3. Rasieren Sie die Bauch-Fell auf dem suprapubischen Bereich um den Brustkorb mit einer Schere und einem feinen Sägeblatt (Oster # 40 Klinge). Desinfizieren Sie den Bauch mit 70% Ethanol, 10% Povidon-Iod (Betadine), eineRunde 70% Ethanol, sequentiell. Bewegen Sie die Maus Bauch nach unten auf einem sterilen Tuch und dann auf einem Heizkissen oder warme Platte (37 ° C) für 2-5 Minuten eingestellt.
  4. Inzision der Bauchhaut in der ventralen Mittellinie mit Ball-bestückte Schere. Verlängern Sie die Inzision für 10-14 mm. Identifizieren Sie die Linea alba, eine avaskuläre, weiß Bindegewebe Band entlang der ventralen Mittellinie der Bauchwand. Inzision der Linea alba mit Kugel gekippt Schere und erweitern den Schnitt 10-14 mm. Unmittelbar bewässern den Bauch mit vorgewärmtem (37 ° C) Ringer-Laktat-Lösung.
  5. Externalisieren die beiden Hörner des Uterus mit Ring Zange ohne übermäßigen Druck auf den Nidationsstellen. Spülen Sie die ausgelagerten Uterushörner mit vorgewärmtem, Ringer-Laktat-Lösung.

2. Transuterine Mikroinjektion

  1. Fertigen Sie ein dickwandiges, Borosilikatglas Kapillare Mikroinjektion Pipette mit den folgenden Merkmalen: 12-16 μm Außendurchmesser und eine 20-Grad-Schräge. Auf einer Sutter P-97 Pipette Abzieher mit kleinen Kasten Filament, verwenden Sie das folgende Programm: Wärme = Rampe Test plus 3 Einheiten; Druck = 200; ziehen = 0; Geschwindigkeit = 46; Zeit = 100). Mit dem Sutter BV-10 Beveler, verwenden Sie den 104C (Gold) Schleifscheibe mit großem Durchmesser für Pipetten. Resuspendieren Expressionsplasmid bei 3-4 g / ul in Calcium-freier phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,2-7,4). In kristallinen schnell grün zu dem konzentrierten DNA, vorsichtig vortexen für 30 Sekunden, und Spin bei 10.000 g für 10 Sekunden. Die minimale Menge an schnell grün erforderlich ist, um visuell verfolgen die Wirksamkeit der Injektion wird empirisch bestimmt. Verfüllen die abgeschrägte Pipette mit dem DNA / schnell grüne Lösung. Verbinden des geladenen Mikroinjektion Pipette auf die Pipettenhalter der Injektor (Picospritzer mit> 99% reinem Stickstoff als Quellengas).
  2. Durchleuchten die Gebärmutter mit geringer Intensität, Halogenlicht, um den Embryo in seinem Implantationsstelle zu visualisieren. Identifizieren Sie den BEATing Herz, Gehirn Vesikel, Gliedmaßenknospen, im Entstehen begriffenen 4. Ventrikel des Hinterhirn und Auge. Spülen des Uterus alle 2 Minuten mit vorgewärmtem, Ringer-Laktat-Lösung, um die Hydratisierung zu halten. Drücken Sie vorsichtig auf die Gebärmutter, um den Embryo neu zu orientieren und Identifizierung der anatomischen Landmarken oben erwähnt.
  3. Orient der Embryo, um den primären Kopf Vene, deren vordere und hintere Äste flankieren den mesenchymalen Gebiet, in dem die otocyst wohnt identifizieren. Die otocyst selbst kann nicht durch Durchleuchtung des Uterus werden. Die otocyst in der Mitte zwischen den vorderen und hinteren Äste der primären Kopf Vene, die, zusammen mit dem Hauptstamm der Vene, bilden die Form der Pfosten oder Torpfosten auf einem American-Football-Feld befindet. Die otocyst in der Mitte zwischen den Pfosten.
  4. Legen Sie die Injektionspipette durch die Gebärmutter in einer Bahn im Einklang mit dem mutmaßlichen Ort der otocyst. Impuls die Mikroinjektorkopfs einmal nach dem Durchlaufen der uteruns zur Visualisierung der Tracer-Farbstoff und die ungefähre die Position der Pipettenspitze. Schieben Sie die Pipette unter Mikrometer-Steuerung und Puls wieder in die Tiefe zu beurteilen. Weiter voranzutreiben Sie die Pipette in die seitliche Kopf Mesenchym und Puls wiederholt. Erfolgreiche otocyst Targeting wird zeigen, die sich verjüngende Form des Ductus endolymphaticus dorsal und der Jakobsmuschel-Form der Apsis. Lassen Sie den Druck auf die Gebärmutter, entfernen Sie die Pipette aus dem Embryo / Gebärmutter in einer Bewegung, und sofort bewässern die Gebärmutter mit vorgewärmtem, Ringer-Laktat-Lösung.

3. In vivo Elektroporation

  1. Spülen Sie die Gebärmutter mit Ringer-Laktat-Lösung. Frisch aufgetragen Ringer-Laktat-Lösung ist notwendig, um elektrisch zu koppeln, die Paddel-Stil Elektroden in die Gebärmutter. Befeuchten Sie die Wolfram-Oberflächen der Elektroden mit Ringer-Laktat. Zentrum des eingespritzten otocyst in dem Weg der Elektroden. Sanft komprimieren die Gebärmutter mit der Elektroporation paddles. Die Kathode ist in Kontakt mit der Uteruswand quer zur injiziert otocyst und die Anode in Kontakt mit der Uteruswand benachbart zu der injizierten otocyst. Lösen Sie eine Rechteckimpuls Zug mit dem Fußpedal-Schalter auf der Elektroporator. Die Elektroporation Parameter sind: 5, 50 ms Pulse bei 43 Volt pro Puls und einer 950 ms Zwischenpulsverzögerung. Unmittelbar bewässern die Gebärmutter nach der Impulsfolge wird ausgeliefert. Notieren Sie die aktuelle Lieferung an das Gewebe: 60-100 mAmps ist ausreichend, um epithelialen Vorläuferzellen otic transfizieren. Injizieren und elektroporieren 4-6, E11.5 Embryonen pro Muttertier.
  2. Durchführen einer zweiten, unabhängigen transuterine Mikroinjektion von wässrigen fluoreszierenden Dextran (Alexa Fluor 488, wenn der Ausdruck Plasmid codiert ein rot fluoreszierendes Protein oder Alex Fluor 594, wenn das Expressionsplasmid kodiert für ein grün fluoreszierendes Protein) in der 4. Ventrikels dieser Embryonen, deren innere Ohren genau gespritzt und mindestens 60 mAmps von Strom pro Puls war deangeliefert bei der Elektroporation. Das fluoreszierende Dextran wird bei der Geburt nachweisbar im Hinterhirn und ermöglichen die Auswahl der Jungtiere, deren innere Ohren wurden während der Embryogenese manipuliert (siehe 3.5).
  3. Spülen Sie die Uterushörner mit Ringer-Laktat. Setzen Sie die Uterushörner in die Bauchhöhle. Spülen Sie die Gebärmutterhöhle mit 2-4 ml vorgewärmtem, Ringer-Laktat-Lösung und damit der Überlauf abfließen aus dem Inzisionsstelle auf den sterilen Tuch. Ersetzen Sie die Drapierungen bei trockenen, sterilen Material. Nähen Sie die Bauchdecke mit einer nicht schneidenden Nadel und einem resorbierbaren Nahtmaterial 6-0. Wir bevorzugen eine Vorstich, Sperren jede zweite Masche, sowohl für die Bauchdecke und die Haut.
  4. Trocknen Sie die Dämme 'Fell und zu verwalten, eine nicht-steroidale Entzündungshemmer wie Meloxicam durch subkutane Injektion. Bringen Sie den Damm auf die vorgewärmten Erholung Käfig auf einem sterilen Tuch. Überwachen und Aufzeichnen der Dämme 'Atmung, Inzisionsstelle Durchgängigkeit und Vagina für blutigen Ausfluss. Blutungen sind rawieder, aber wenn vorhanden und unvermindert, einschläfern den Damm, während sie noch unter Narkose. Notieren Sie sich die Zeit, sie wieder zu sich und versucht, ambulate. Bringen Sie den Damm auf die Maus Kolonie, als sie Anzeichen für Essen und Trinken zeigt, und hat damit begonnen, Nest zu bauen. Normalerweise passiert dies innerhalb von 12 Stunden.
  5. Bei der Geburt (postnatalen Tag 0), setzen Sie das Flash-Hinterhirn Bereich jeder Welpe im Wurf, den fluoreszierenden Dextran mit einem stereofluorescence Binokular mit einem GFP-oder Texas Red-Filter erkennt nach Bedarf. Zurück zur säugenden Mutter nur jene Welpen, die Rautenhirn Kennzeichnung anzuzeigen.

4. Repräsentative Ergebnisse

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Abbildung 1. Elektroporation vermittelte Gentransfer in die Entwicklung von Cochlea. Die E11.5 otocyst wurde mit einem Expressionsplasmids Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) und elektroporierten injiziert (Puls train-Parameter: fünf, 43-Volt-Impulsen bei 50 ms / 950 ms Puls-und Puls-Verzögerung). A) ein Vertreter des Innenohrs von einer postnatalen Tag 6 (P6), deren Welpen otocyst wurde injiziert und bei E11.5 elektroporiert demonstrieren EGFP-Expression von der Basis durch die Mitte Windung der Cochlea. Die laterale Wand der Cochlea wurde aus der Mitte und der Spitze wiederum nur entfernt. E11.5 Vorfahren, die Anlass zu der Spitze wurden nicht transfiziert. B) Immunfärbung Whole mount in der Cochlea (A) mit dem Haar-Zell-Marker, zeigt Myosin 7a (MYO7A), dass EGFP-Expression folgt die Flugbahn des Corti-Organ und wird grob an die Haarzelle tragenden Sinnesepithel lokalisiert. C) einem Vertreter des Innenohrs von einem Embryo, dessen E18.5 otocyst wurde injiziert und bei E11.5 elektroporiert. Die Laser-Projektion zeigt konfokale EGFP-Expression in MYO7A-positiven sensorischen Haarzellen. D) konfokalen Laser-Projektion des Cochlea-Sinnesepithel aus dem E18.5 Corti-Organ anzeigt EGFP expression in der inneren Haarzellen (IHC), äußeren Haarzellen (OHC), innere phalangial Zellen (IPC), Pfeiler-Zellen (PC) und Deiters 'Zellen (DC). Der Balken in (B) gilt für (A).

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Diskussion

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Gentransfer in sich entwickelnden Maus Innenohr: Das Innenohr der Maus entwickelt sich aus der Ohrplakode während der ersten Woche der Einnistung Entwicklung 12,13. Von embryonalen Tag 9,5 (E9.5) hat die Plakode eingestülpt und verwandelte sich in einem mit Flüssigkeit gefüllten Vesikel genannt otocyst 2. Otic Vorstufen in der Blase führen zu den sensorischen und nichtsinnlichen Zellen innerhalb des reifen Innenohr sowie die Neuronen, die mechanisch empfindlichen Haarzellen innervi...

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Offenlegungen

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

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Wir bedanken uns bei Humana Press für die Erlaubnis, die Mikroinjektion Pipette Herstellung Figur, die ursprünglich auf Seite 130 der Verweis 11 erschienen zu veröffentlichen; Larry Dlugas und Steven Wong, OHSU Abteilung Pädagogische Kommunikation, für die Videografie; Larry Dlugas für Video-Design und-Bearbeitung; Adam M. O 'Quinn, Senior Designer, Trion / Envirco für die Gestaltung unserer kundenspezifischen horizontale Laminarströmungshaube und Les Goldsmith für die Bereitstellung der technischen schematische; Monterroso Victor, MW, MS, PhD und Tom Chatkupt, DVM, OHSU Abteilung für Vergleichende Medizin, zur Orientierung mit unseren Tierpflege-Protokoll, chirurgische Techniken, und eine prophylaktische Therapie Analgesie; Marcel Perret-Gentil, DVM, MS, für die gemeinsame Nutzung seiner Handzettel auf tierärztliche Nahttechniken; Edward Porsov, MS, für die Gestaltung unserer Adobe Premiere Pro Video-Mikroskopie Computer-Arbeitsplatz, und Leah und Weiß Jonas Hinckley von LNS Captioning (Portland, OR). Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Institute on Taubheit und anderen, unterstütztr Communication Disorders: DC-und DC-008595 R01 R01 008.595-04S2 (JB) und P30 DC005983 (Oregon Hearing Research Center Core-Grant, Peter Gillespie, Principal Investigator).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Name des Reagenzes Firma Katalog-Nummer Kommentare
Micro Sterilisieren Gehäuse Roboz RS-9900a 8X8.5X1.25 Zoll
Kugel-bestückte Schere Fine Science Tools 14109-09
Ring Zange Fine Science Tools 11106-09 4,8 mm ID/6mm OD
Adson Pinzette Fine Science Tools 11027-12
Nadeltreiber Fine Science Tools 12502-12
Allergie Spritzentablett Becton Dickison 305536
Suture 6-0 Syneture GL-889 0,7 metrischen Magen-Darm-Naht
Ringer-Lactat-Injektion USP Baxter 2B2323
Schnell grün Sigma Aldrich F7258
Borosilikatglas Kapillare Harvard Apparatus 30-0053
Nembutal Natriumlösung OVATION Pharmaceuticals Inc. NDC 67386-501-52
MgSO4.7H2O Fisher Scientific M63-500
Propylenglykol Fisher Scientific P355-1
Ethanol Sigma Aldrich E7023-500
Meloxicam Boehringer Ingeheim NADA 141-219
Feinpipettenziehvorrichtung Sutter Instruments P-97 FB255B Box Filament; konsultieren Pipette Kochbuch von Sutter Instrumente
Mikroelektroden Beveler Sutter Instruments BV-10 104C Abschrägung Festplatte für große Pipetten, konsultieren Sie in der Bedienungsanleitung Anfasen Theorie
Mikropipette Halter Warner Instruments MP-S15T Für 1,5 mm Außendurchmesser Pipette und weiblichen Druckanschluss für Picospritzer Schlauch.
Pinzetten-Stil Elektrode Protech International Inc. CUY650P5 5 mm Außendurchmesser
Square Wave Electroporator Protech International Inc. CUY21EDIT Footpedal empfohlenen
PICOSPRITZER III Parker Hannifin 051-0500-900 Footpedal empfohlenen
Manuelle Steuerung Mikromanipulator Harvard Apparatus 640056
Horizontale Laminar-Flow Sterilbank Envirco Kundenspezifische Modifikationen an LF 630-10554. Siehe ergänzende Informationen für schematische Kapuze.
Leica stereofluorescence Sezieren microcope mit Lumencor Sola Light Engine Bartels und Stout und Lumencor MZ10F mit Lumencor Sola Light Engine Footpedals die MZ10F zu konzentrieren und die Sola Light Engine auslösen werden empfohlen
Alexa Fluor 594 Dextran Invitrogen D22913 10mg/ml, wässrigen
Alexa Fluor 488 Dextran Invitrogen D22910 10mg/ml, wässrigen
Enviro-dri Shepherd Sonstige PapERS www.ssponline.com

Referenzen

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Ventrale Laparotomietransuterine MikroinjektionInjektion in die Otik VesikelEmbryonaltag 115GentransfertechnikPaddel ElektrodenGFP ExpressionsanalyseTierschutzprotokoll

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