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Methodenartikel

Verwendung von Interferon-γ enzyme-linked immunospot Assay zur Novel T-Zell-Epitope des humanen Papillomvirus Charakterisieren

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DOI:

10.3791/3657

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8. März 2012

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Parasitology, College of Basic Medical Sciences, China Medical University , 2Department of Obstetrics and Gynecology, College of Medicine, University of Arkansas for Medical Sciences , 3Department of Pathology, College of Medicine, University of Arkansas for Medical Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Charakterisierung von T-Zell-Epitopen von Krankheitserregern, die lokalisierte Infektionen wie das humane Papillomvirus verursachen, ist aufgrund der begrenzten Anzahl von T-Zellen im Umlauf eine Herausforderung. Es wird eine Methode beschrieben, bei der seltene T-Zellen isoliert und charakterisiert wurden, ausgehend von einer sehr geringen Anzahl von Zellen.

Zusammenfassung

Es wurde ein Protokoll entwickelt, um die Schwierigkeiten bei der Isolierung und Charakterisierung seltener, auf Krankheitserreger spezifischer T-Zellen zu überwinden, wie beispielsweise humanes Papillomavirus (HPV), das lokal begrenzte Infektionen verursacht. Die beteiligten Schritte umfassen die Identifizierung von Region(en) in HPV-Proteinen, die T-Zell-Epitop(e) von einem Probanden enthalten, die Selektion peptidspezifischer T-Zellen basierend auf der Sekretion von Interferon-γ (IFN-γ) sowie das Anzüchten und die Charakterisierung der T-Zell-Klone (Abb. 1). Proband 1 war ein Patient, bei dem kürzlich mittels Biopsie eine hochgradige intraepitheliale Plattenepithelläsion diagnostiziert worden war und der am Tag der T-Zell-Gewinnung eine elektrische Schlingenexzision zur Behandlung erhalten hatte1. Eine Region innerhalb der Proteine E6 und E7 des humanen Papillomavirus Typ 16 (HPV 16) wurde identifiziert, die ein T-Zell-Epitop enthält, und zwar mithilfe eines IFN-γ-Enzyme-Linked-Immunospot-(ELISPOT)-Assays, der mit überlappenden synthetischen Peptiden durchgeführt wurde (Abb. 2). Die Daten aus diesem Assay wurden nicht nur zur Identifizierung einer Region mit einem T-Zell-Epitop verwendet, sondern auch zur Abschätzung der Anzahl epitopspezifischer T-Zellen und zur Isolierung dieser Zellen anhand ihrer IFN-γ-Sekretion unter Verwendung kommerziell erhältlicher magnetischer Partikel (CD8-T-Zell-Isolationskit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). Die ausgewählten IFN-γ-sekretierenden T-Zellen wurden verdünnt und einzeln in Gegenwart eines bestrahlten Futterzellen-Gemischs kultiviert, um das Wachstum einer einzelnen T-Zelle pro Mulde zu ermöglichen. Diese T-Zell-Klone wurden mittels eines IFN-γ-ELISPOT-Assays getestet, wobei Peptide verwendet wurden, die die identifizierte Region abdecken, sowie autologe, mit Epstein-Barr-Virus transformierte B-Lymphoblastoide Zellen (LCLs, wie von Walls und Crawford beschrieben beschafft)2, um die benötigte Anzahl an T-Zell-Klon-Zellen zu minimieren. Anstelle der üblicherweise im ELISPOT-Assay verwendeten 1 × 105 Zellen pro Mulde1,3 kamen 1.000 T-Zell-Klon-Zellen in Gegenwart von 1 × 105 autologen LCLs zum Einsatz, wodurch die benötigte Anzahl an T-Zell-Klon-Zellen drastisch reduziert wurde. Die autologen LCLs dienten nicht nur der Präsentation von Peptidantigenen an die T-Zell-Klon-Zellen, sondern sorgten auch für eine hohe Zelldichte in den Mullen, wodurch die epitopspezifischen T-Zell-Klon-Zellen IFN-γ sezernieren konnten. Dies gewährleistet eine erfolgreiche Durchführung des IFN-γ-ELISPOT-Assays. Ebenso wurden IFN-γ-ELISPOT-Assays verwendet, um die minimale und optimale Aminosäuresequenz des CD8-T-Zell-Epitops (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) und sein HLA-Klasse-I-Restriktionselement (B58) zu charakterisieren. Der IFN-γ-ELISPOT-Assay wurde außerdem mit autologen LCLs durchgeführt, die mit Vaccinia-Virus infiziert waren, das das HPV-16-E6- oder E7-Protein exprimierte. Das Ergebnis zeigte, dass das E6-T-Zell-Epitop endogen prozessiert wurde. Die Kreuzerkennung homologer T-Zell-Epitope anderer hochriskanter HPV-Typen wurde nachgewiesen. Diese Methode kann ebenfalls zur Beschreibung von CD4-T-Zell-Epitopen verwendet werden4.

Protokoll

Durch die Durchführung eines IFN-γ-ELISPOT-Assays mit einer aus Proband 1 etablierten CD8-T-Zelllinie wurde festgestellt, dass die Region HPV 16 E6 46-70 ein T-Zell-Epitop enthält1 (Abb. 2), und die epitopspezifischen T-Zellen wurden vor Beginn dieses Protokolls basierend auf der Sekretion von IFN-γ ausgewählt (Abb. 1).

1. Limitierende Verdünnung epitopspezifischer T-Zellen

  1. Bereiten Sie die Fütterungszellmischung vor, indem Sie bestrahlte (4.000 rad) allogene periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) mit einer Dichte von 5 × 105 Zellen/ml, bestrahlte (5.000 rad) allogene LCLs mit einer Dichte von 5 × 104 Zellen/ml und Phytohämaggglutinin (PHA) mit einer Konzentration von 0,1 μg/ml in vollständigem Yssel-Medium, das 1 % gepooltes humanes Serum enthält, miteinander vermengen. Die Zellen müssen während des gesamten Protokolls unter sterilen Bedingungen gehandhabt werden.
  2. Verdünnen Sie die isolierten epitopspezifischen T-Zellen (Abb. 3) seriell in der Fütterungszellmischung, bis die Konzentration 0,5 Zelle/100 μl oder 5 Zellen/1 ml erreicht. Verwenden Sie etwa 3 × 103 epitopspezifische T-Zellen.
  3. Geben Sie 100 μl/Vertiefung der verdünnten epitopspezifischen T-Zellen mithilfe eines Mehrkanalpipettors insgesamt in 30 bis 60 96-Loch-Rundbodenplatten.
  4. Inkubieren Sie die Platten in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2.
  5. Geben Sie am Tag 5 jeweils 100 μl vollständiges Yssel-Medium mit 20 U/ml rekombinantem humanem Interleukin-2 (rhIL-2) hinzu.
  6. Identifizieren Sie wachsende T-Zellklone in den 96-Loch-Rundbodenplatten visuell anhand ihrer großen Zellpellets am Boden.
  7. Bereiten Sie am Tag 11 bis 14 eine neue Fütterungszellmischung vor, indem Sie bestrahlte (4.000 rad) allogene PBMCs mit einer Dichte von 1 × 106 Zellen/ml, bestrahlte (5.000 rad) allogene LCLs mit einer Dichte von 1 × 105 Zellen/ml und PHA mit einer Konzentration von 0,1 μg/ml in vollständigem Yssel-Medium kombinieren. Geben Sie diese neue Fütterungszellmischung mit 1 ml/Vertiefung in eine 24-Loch-Platte.
  8. Aspirieren Sie die T-Zellklone einzeln aus jeder Vertiefung mithilfe einer Mikropipette mit einem Fassungsvermögen von etwa 200 μl.
  9. Geben Sie die T-Zellklone einzeln in die 24-Loch-Platte mit der neuen Fütterungszellmischung. Wiederholen Sie dies, bis alle T-Zellklone übertragen wurden.

2. Identifizierung epitop-spezifischer T-Zellklone mittels eines Hochdurchsatz-ELISPOT-Screenings (angepasst nach einer Methode von Larsson et al.5)

  1. Beschichten Sie 2 sterile ELISPOT-Platten (Multiscreen-HA; Millipore, Bedford, MA) mit jeweils 50 μl primärer anti-IFN-γ monoklonaler Antikörper (Klon D1K, Mabtech, Stockholm, Schweden), verdünnt auf 5 μg/ml in steriler, zellkulturgeeigneter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), mindestens 1 Stunde bei 4 °C.
  2. Waschen Sie die Vertiefungen mit jeweils 150 bis 200 μl PBS durch Zugabe und anschließendes Entsorgen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
  3. Blockieren Sie unspezifische Bindungen durch Zugabe von jeweils 50 μl gepooltem humanem Serum, verdünnt auf 5 % in RPMI 1640, pro Vertiefung für mindestens 1 Stunde bei 37 °C, 5 % CO2. Entfernen Sie größere Luftblasen, indem Sie sie mit einer sterilen Nadel platzen lassen.
  4. Geben Sie 1 × 105 autologe LCLs2 in jeweils 50 μl RPMI 1640 mit 5 % humanem Serum pro Vertiefung in die Platte.
  5. Mischen Sie die Zellen in jeder Vertiefung der 24-Loch-Platte, die T-Zellklone enthält, mit einer 1-ml-Pipette. Übertragen Sie jeweils 100 μl pro Vertiefung in ein steriles Eppendorf-Röhrchen. Fügen Sie jedem Eppendorf-Röhrchen 500 μl RPMI 1640 mit 5 % gepooltem humanem Serum hinzu und zentrifugieren Sie in einer Mikrozentrifuge bei 3.000 U/min für 5 Minuten.
  6. Entfernen Sie die Überstände aus den Eppendorf-Röhrchen, geben Sie jeweils 110 μl RPMI 1640 mit 5 % humanem Serum pro Röhrchen hinzu und resuspendieren Sie die Zellen durch Vortexen.
  7. Geben Sie jeweils 50 μl Medium, das einen bestimmten T-Zellklon enthält, unabhängig von der Zellzahl zur schnellen Analyse, in entsprechend positionierte Vertiefungen der beiden Platten. Wiederholen Sie dies für alle T-Zellklone. Durch Wegfall der Zellzählung können viele T-Zellklone gleichzeitig getestet werden.
  8. Vereinigen Sie das verbleibende Medium aus mehreren Eppendorf-Röhrchen und geben Sie jeweils 50 μl in die nächsten entsprechend positionierten Vertiefungen, die als positive Kontrollvertiefungen dienen, zu denen PHA hinzugefügt wird.
  9. Geben Sie jeweils 50 μl RPMI 1640 mit 5 % gepooltem humanem Serum in jede Vertiefung, die als negative Kontrolle dient und keine T-Zellklone enthält.
  10. Fügen Sie die in der positiven Region enthaltenen Peptide (Tabelle 1) in jeweils 50 μl/Vertiefung hinzu, sodass eine Endkonzentration von 10 μM/Peptid erreicht wird. Die Peptid-Stammlösungen sind je nach Löslichkeit der Peptide einzeln in 5–15 % Dimethylsulfoxid in PBS auf 5 mM gelöst. Jede Vertiefung enthält insgesamt 200 μl (50 μl Blockierungslösung, 50 μl LCLs, 50 μl T-Zellklone und 50 μl Peptide).
  11. Geben Sie jeweils 50 μl PHA (Endkonzentration 10 μg/ml) in die positiven Kontrollvertiefungen.
  12. Geben Sie jeweils 50 μl RPMI 1640 mit 5 % gepooltem humanem Serum in die negativen Kontrollvertiefungen.
  13. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C, 5 % CO2.
  14. Waschen Sie die Vertiefungen mit jeweils 150 bis 200 μl PBS mit 0,05 % Tween-20 durch Zugabe und anschließendes Entsorgen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
  15. Geben Sie jeweils 50 μl PBS mit 1 μg/ml biotinyliertem anti-IFN-γ monoklonalem Antikörper (Klon 7B-6, Mabtech) hinzu und inkubieren Sie 2 Stunden bei 37 °C, 5 % CO2. Entfernen Sie größere Luftblasen, indem Sie sie mit einer Nadel platzen lassen.
  16. 20 Minuten vor Ende der 2-stündigen Inkubation bereiten Sie das mit Avidin verbundene biotinylierte HRP (Vectastain Elite ABC Kit; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) vor, indem Sie jeweils 2 Tropfen Lösung A und Lösung B zu 5 ml PBS mit 0,1 % Tween-20 hinzufügen.
  17. Waschen Sie die Vertiefungen mit jeweils 150 bis 200 μl PBS mit 0,1 % Tween-20 durch Zugabe und anschließendes Entsorgen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
  18. Geben Sie jeweils 50 μl des biotinylierten HRP pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie 1 Stunde bei 37 °C, 5 % CO2. Entfernen Sie größere Luftblasen, indem Sie sie mit einer Nadel platzen lassen.
  19. Waschen Sie die Vertiefungen mit jeweils 150 bis 200 μl PBS mit 0,1 % Tween-20 durch Zugabe und anschließendes Entsorgen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
  20. Geben Sie jeweils 50 μl eines Farbreagens, stabiles Diaminobenzidin (DAB), pro Vertiefung bei Raumtemperatur für 5 Minuten hinzu. Entfernen Sie größere Luftblasen, indem Sie sie mit einer Nadel platzen lassen.
  21. Waschen Sie die Vertiefungen mit jeweils 150 bis 200 μl entionisiertem Wasser durch Zugabe und anschließendes Entsorgen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
  22. Lassen Sie die Platte vollständig trocknen.
  23. Zählen Sie die Flecken mit einem Stereomikroskop oder einem automatisierten ELISPOT-Lesegerät (AID ELISPOT Classic Reader; Autoimmun Diagnostika GmbH, Strassberg, Deutschland).

3. Bestätigung der epitopspezifischen Natur der T-Zellklone mittels ELISPOT-Assay (Abb. 4)

  1. Wählen Sie gut wachsende T-Zellklone aus. Führen Sie einen ELISPOT-Test wie oben beschrieben durch, wobei jedoch 1 × 105 autologe LCLs und 1 × 103 T-Zellklon-Zellen pro Mulde zusammen mit jeweils einem der drei in der Region enthaltenen Peptide (Tabelle 1) bei 10 μM angesetzt werden. Richten Sie den Test in Duplikaten oder Triplikaten ein.

4. Bestimmung, ob das Epitop endogen verarbeitet wird (Abb. 5)

  1. Wählen Sie gut wachsende T-Zellklone aus. Führen Sie einen ELISPOT-Assay wie oben beschrieben durch, wobei jedoch 1 x 105 autologe LCLs, die mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus infiziert wurden, das HPV16 E6, E7 6 exprimiert (vor dem Assay) oder nicht (Wildtyp, Stamm WR) (Multiplizität der Infektion von 5 für 1 Stunde), sowie jeweils 1 x 103 T-Zellklon-Zellen pro Vertiefung ausplattiert werden.

5. Charakterisierung der minimalen und optimalen Sequenz des T-Zell-Epitops (Abb. 6a, 6b und 6c)

  1. Wählen Sie gut wachsende T-Zellklone aus. Führen Sie einen ELISPOT-Assay wie oben beschrieben durch, wobei jedoch 1 × 105 autologe LCLs und 1 × 103 T-Zellklon-Zellen pro Vertiefung zusammen mit jeweils einem der überlappenden 9-mer-Peptide, die den Bereich abdecken (Tabelle 1), bei 10 μM inkubiert werden (Abb. 6a).
  2. Führen Sie einen ELISPOT-Assay wie oben beschrieben durch, wobei jedoch 1 × 105 autologe LCLs und 1 × 103 T-Zellklon-Zellen pro Vertiefung zusammen mit jeweils einem der Peptide aus einer Serie mit variabler Länge (Tabelle 1) bei 10 μM inkubiert werden (Abb. 6b).
  3. Führen Sie einen ELISPOT-Assay wie oben beschrieben durch, wobei jedoch 1 × 105 autologe LCLs und 1 × 103 T-Zellklon-Zellen pro Vertiefung zusammen mit wenigen Peptiden, die am ehesten die minimale und optimale Aminosäuresequenz enthalten, inkubiert werden. Diese Peptide werden in Konzentrationen von 10-5 M bis 10-10 M getestet (Abb. 6c).

6. Identifizierung des Restriktionselements mittels ELISPOT-Assay (Abb. 7)

  1. Wählen Sie gut wachsende T-Zellklone aus. Führen Sie einen ELISPOT-Assay wie oben beschrieben durch, wobei jedoch 1 x 103 T-Zellklon-Zellen pro Vertiefung zusammen mit dem minimalen und optimalen Peptid bei 10 μM ausgesät werden. Außerdem werden je Vertiefung einhunderttausend allogene LCLs, die ein oder zwei HLA-Klasse-I-Moleküle mit dem untersuchten Probanden teilen, ausgesät.

7. Untersuchung der Kreuzreaktivität der Epitop-spezifischen T-Zellklone gegenüber homologen Aminosäuresequenzen aus anderen Hochrisiko-HPV-Typen (Abb. 8)

  1. Wählen Sie gut wachsende T-Zellklone aus. Führen Sie einen ELISPOT-Test wie oben beschrieben durch, wobei jedoch 1 × 103 Zellen pro T-Zellklon pro Vertiefung zusammen mit Peptiden (10 μM) gepflanzt werden, die homologe Aminosäuresequenzen aus anderen Hochrisiko-HPV-Typen enthalten (Tabelle 2). Außerdem werden je 100.000 autologe LCLs pro Vertiefung sowie allogene LCLs, die die einschränkenden HLA-Klasse-I-Moleküle exprimieren, in jeweils separaten Vertiefungen gepflanzt.

8. Repräsentative Ergebnisse

Das hier vorgestellte Subjekt 1 war eine 22-jährige afroamerikanische Frau mit einer kürzlich mittels Biopsie diagnostizierten hochgradigen squamösen intraepithelialen Läsion. Sie stellte sich am Tag der T-Zell-Gewinnung zur Behandlung mittels Schleifenexzision (loop electrical excision procedure) vor1. Der ELISPOT-Assay ihrer CD8-T-Zelllinie zeigte, dass die Region HPV 16 E6 46-70 (jede Region wird mit drei überlappenden 15-mer-Peptiden getestet) ein T-Zell-Epitop enthält (Abb. 2). Die Zahl der epitopspezifischen T-Zellen, die basierend auf der Sekretion von IFN-γ ausgewählt wurden, betrug 1,2 × 105. Nach Durchführung einer limitierenden Verdünnung (Abb. 3) an einem Fünftel der ausgewählten Zellen wurden 262 T-Zellklone gewonnen. Die verbleibenden ausgewählten Zellen wurden nicht verwendet, da der erste Versuch der T-Zell-Klonierung erfolgreich war. Das Hochdurchsatz-Screening mittels ELISPOT-Assay an 94 dieser Klone identifizierte 62 screenpositive Klone, die makroskopisch leicht auf der ELISPOT-Platte erkennbar waren. Die übrigen T-Zellklone wurden nicht getestet, da der erste ELISPOT-Assay bereits peptidspezifische T-Zellklone identifiziert hatte. Acht gut wachsende screenpositive Klone wurden erneut mit den drei einzelnen 15-mer-Peptiden, die die Region abdecken, getestet (Abb. 4). Alle T-Zellklone reagierten positiv auf die HPV-16-E6-51-65-Peptide, 6 von 8 Klonen reagierten positiv auf das E6-46-60-Peptid, und keiner der Klone reagierte positiv auf das E6-56-70-Peptid. Tests mit autologen LCLs, die mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus infiziert waren, das das HPV-16-E6- oder E7-Protein exprimierte, zeigten, dass die T-Zellklone ein endogen verarbeitetes E6-Epitop erkennen (Abb. 5). Die Untersuchung mit einer Serie überlappender 9-mer-Peptide, die die HPV-16-46-65-Region abdecken (Tabelle 1), ergab die stärkste Reaktion mit dem E6-53-61-Peptid (Abb. 6a). Die beiden 10-mer-Peptide, die das E6-53-61-Peptid enthalten, die beiden 8-mer-Peptide, die im E6-53-61-Peptid enthalten sind, sowie ein 11-mer-Peptid, das die beiden 10-mer-Peptide enthält, wurden getestet, und das E6-52-61-(10-mer)-Peptid erwies sich als die minimale und optimale Sequenz, und zwar am konsistentesten (Abb. 6b). Das E6-53-61-(9-mer)-Peptid zeigte jedoch mit dem T-Zellklon #79 eine gleich starke Reaktion. Dieser T-Zellklon wurde mit diesen beiden Peptiden über einen breiteren Konzentrationsbereich getestet, und das E6-52-61-(10-mer)-Peptid behielt die Positivität bei niedrigeren Peptidkonzentrationen deutlich besser aufrecht als das E6-53-61-(9-mer)-Peptid (Abb. 6c). Das längere E6-52-62-(11-mer)-Peptid wurde nicht getestet, da das Ziel darin bestand, die kürzeste Sequenz zu definieren, die eine robuste Reaktion hervorruft. Das E6-52-61-(10-mer)-Peptid wurde als die minimale und optimale Sequenz identifiziert.

Das einschränkende HLA-Klasse-I-Molekül des CD8-T-Zell-Epitops kann mittels eines ELISPOT-Assays untersucht werden, der allogene LCLs verwendet, welche ein oder zwei mit dem Probanden gemeinsame HLA-Klasse-I-Moleküle exprimieren. Die Ergebnisse für Proband 1 waren jedoch aufgrund einer hohen Hintergrundreaktion im ELISPOT-Assay nicht schlüssig. Das einschränkende HLA-Klasse-I-Molekül für Proband 1 wurde anschließend mittels eines Chromfreisetzungsassays als B58 identifiziert (Daten nicht gezeigt). Abb. 7 zeigt ein Beispiel eines anderen Probanden [Proband A, bei dem festgestellt wurde, dass er die minimale und optimale Sequenz von E6 75-83 (KFYSKISEY) erkennt, wie von Wang et al. beschrieben]7. Eine starke Positivität ist mit einer LCL, die die Moleküle B62 und Cw3 exprimiert, zu beobachten, während eine Hintergrundreaktion mit einer LCL, die Cw3 exprimiert, auftritt. Ein Chromfreisetzungsassay bestätigte, dass das Molekül B62 das einschränkende Element für Proband A darstellt7.

Einige Regionen des HPV-Genoms sind stark konserviert, und homologe Sequenzen zu den HPV-16-E6-52-61-Regionen waren in 13 weiteren hochriskanten HPV-Typen vorhanden (Tabelle 2). Eine starke Kreuzerkennung (>50 % der Spot-bildenden Einheiten für das HPV-16-E6-52-61-Peptid) wurde für 8 der 13 hochriskanten HPV-Typen nachgewiesen (Abb. 8).

Flussdiagramm zur Identifizierung von T-Zell-Epitopen mittels ELISPOT-Assay; die Prozesse umfassen Isolierung und Analyse.
Abbildung 1. Übersichtsschema, das die Versuchsreihe zur Charakterisierung neuartiger T-Zell-Epitope darstellt. Diese Arbeit beschreibt das Protokoll ausgehend vom dritten Kasten von oben.

Balkendiagramm der Immunantwort, spotbildende Einheiten vs. Peptidregionen, dominanter Peak in E6 beobachtet.
Abbildung 2. Ein ELISPOT-Assay, durchgeführt zur Identifizierung der Region(en), die das T-Zell-Epitop enthalten. Je Brunnen wurden einhunderttausend in vitro stimulierte CD8-T-Zellen zusammen mit drei 15-mer überlappenden Peptiden (jeweils 10 μM) aufgebracht, die jeweils die Regionen innerhalb der HPV-16-E6- und E7-Proteine abdecken. Dieses Beispiel von Proband 1 zeigte das Vorhandensein eines T-Zell-Epitops in der E6-46-70-Region. Die Balken stellen die Standardfehler der Mittelwerte dar.

Schema des Verdünnungsprozesses für die Zellkultur, schrittweise Verdünnung, um 0,5 Zellen pro Vertiefung zu erreichen.
Abbildung 3. Ein Schema, das zeigt, wie epitopspezifische T-Zellen mithilfe eines Fütterungszellgemischs auf eine Konzentration von 0,5 Zellen pro Vertiefung verdünnt werden.

Balkendiagramm der spotbildenden Einheiten pro Klon; Vergleich der Peptide PHA, E6 46-60, E6 51-65, E6 56-70.
Abbildung 4. Ein ELISPOT-Assay, der durchgeführt wurde, um Subregionen, die das T-Zell-Epitop enthalten, zu identifizieren, indem die drei 15-meren Peptide einzeln getestet wurden. Dieses Beispiel von Proband 1 zeigte das Vorhandensein des Epitops in den Subregionen E6 46-60 und E6 51-65. Die Balken stellen die Standardfehler der Mittelwerte dar.

Balkendiagramm, spotbildende Einheiten pro Brunnen; Klone #5-79; PHA, E6-Vac, E7-Vac, WR-Assays; Immunantwort.
Abbildung 5. Ein ELISPOT-Assay, der durchgeführt wurde, um zu untersuchen, ob das T-Zell-Epitop endogen präsentiert wird. Dieses Beispiel von Proband 1 zeigte, dass die T-Zellklone ein endogen verarbeitetes E6-Epitop erkannten. Die Balken stellen die Standardfehler der Mittelwerte dar.

Diagramm der spotbildenden Einheiten zur Analyse der Peptidantwort; enthält Balken- und Liniendiagramme mit Klondaten.

Abbildung 6. ELISPOT-Assays zur Charakterisierung der kürzesten und optimalen Peptidsequenz des T-Zell-Epitops. Nach Möglichkeit wurden dieselben Klone verwendet. (a) Ein ELISPOT-Assay, der mit überlappenden 9-mer-Peptiden durchgeführt wurde. Dieses Beispiel von Proband 1 zeigte, dass das Epitop in der E6 53-61-Teilregion liegt. (b) Ein ELISPOT-Assay zur Identifizierung der minimalen und optimalen Peptidsequenz mithilfe von Peptiden unterschiedlicher Länge. Dieses Beispiel zeigte, dass die kürzeste und optimale Peptidsequenz am konstantesten das E6 52-61-Peptid war, gefolgt vom E6 53-61-Peptid. (c) Ein ELISPOT-Assay zur Bestätigung, welches Peptid die minimale und optimale Sequenz enthält. Das E6 52-61-Peptid behielt bei niedrigeren Konzentrationen die Positivität bei und wurde als kürzeste und optimale Sequenz bestimmt. Die Balken stellen die Standardfehler des Mittelwerts dar.

Balkendiagramm der lymphozytären spotbildenden Einheiten pro Klon im Vergleich zwischen autologen und kompatiblen allogenen LCLs.


Abbildung 7. Ein ELISPOT-Assay, der durchgeführt wurde, um das restrierende HLA-Klasse-I-Molekül zu identifizieren. Dieses Beispiel stützt die Annahme, dass das B62-Molekül das Restriktionselement für den CD8-T-Zell-Klon von Proband A ist, der das HPV-16-E6-75-83-Epitop erkennt7. Dies wurde durch einen Chromfreisetzungsassay bestätigt. Die Balken stellen die Standardfehler der Mittelwerte dar.

Balkendiagramm zur HPV-Immunantwort; spotbildende Einheiten pro Mulde; Vergleich autologe/allogene LCL.
Abbildung 8. Ein ELISPOT-Assay, durchgeführt zur Beurteilung der Kreuzreaktivität der HPV-16-52-61-spezifischen T-Zellklone gegenüber ähnlichen Sequenzen anderer hochriskanter HPV-Typen (Tabelle 2). Dieses Beispiel von Proband 1 zeigte eine signifikante Kreuzreaktivität (>50 % der Positivität im Vergleich zu HPV 16 52-61) bei 8 der 13 untersuchten anderen hochriskanten HPV-Typen. Die Balken stellen die Standardfehler der Mittelwerte dar.

HPV-TypAA-Reste*Sequenz^
16E6 46-60 (15)RREVYDFAFRDLCIV
16E6 51-65 (15)DFAFRDLCIVYRDGN
16E6 56-70 (15)DLCIVYRDGNPYAVC
16E6 52-62 (11)FAFRDLCIVYR
16E6 52-61 (10)FAFRDLCIVY
16E6 53-62 (10)AFRDLCIVYR
16E6 46-54 (9)RREVYDFAF
16E6 47-55 (9)REVYDFAFR
16E6 48-56 (9)EVYDFAFRD
16E6 49-57 (9)VYDFAFRDL
16E6 50-58 (9)YDFAFRDLC
16E6 51-59 (9)DFAFRDLCI
16E6 52-60 (9)FAFRDLCIV
16E6 53-61 (9)AFRDLCIVY
16E6 54-62 (9)FRDLCIVYR
16E6 55-63 (9)RDLCIVYRD
16E6 56-64 (9)DLCIVYRDG
16E6 57-65 (9)LCIVYRDGN
16E6 53-60 (8)AFRDLCIV
16E6 54-61 (8)FRDLCIVY

* Die Anzahl der Aminosäuren ist in Klammern angegeben.

Tabelle 1. Aminosäuresequenzen der HPV-16-E6-Peptide, die zur Bestimmung der minimalen und optimalen antigenen Peptidsequenz verwendet wurden.

HPV-TypAA-Reste*Sequenz^
16E6 52-61(10)FAFRDLCIVY
18E6 47-56 (10)FAFKDLFVVY
31E6 45-54 (10)FAFTDLTIVY
33E6 45-54 (10)FAFADLTVVY
35E6 45-54 (10)FACYDLCIVY
39E6 47-56 (10)FAFSDLYVVY
45E6 47-56 (10)FAFSDLYVVY
51E6 45-54 (10)VAFTEIKIVY
52E6 45-54 (10)FLFTDLRIVY
56E6 48-57 (10)FACTELKLVY
58E6 45-54 (10)FVFADLRIVY
59E6 47-56 (10)FAFNDLFIVY
68E6 47-56 (10)FAFGDLNVVY
73E6 45-54 (10)FAFSDLCIVY

* Die Anzahl der Aminosäuren ist in Klammern angegeben.
^ Aminosäurereste, die sich von denen im HPV-16-E6-52-61-Epitop unterscheiden, sind fett gedruckt dargestellt.

Tabelle 2. Aminosäuresequenzen von Peptiden hochgradiger HPV-Typen, die homolog zur HPV 16 E6 52-61 CD8-T-Zell-Epitopsequenz sind und zur Beurteilung der Kreuzerkennung getestet wurden.

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Diskussion

Traditionell versuchten Immunologen, neuartige T-Zell-Epitope zu charakterisieren, indem sie die betreffenden T-Zellen in vitro stimulierten und einen Grenzverdünnungsversuch durchführten, um die epitopspezifischen T-Zellklone zu isolieren. Anschließend wurden die T-Zellklone mittels Chromfreisetzungsassay charakterisiert8,9. Viele Versuche blieben jedoch erfolglos, da die Frequenz der T-Zellen möglicherweise zu gering war, um sie isolieren zu können, oder weil nicht genügend T-Zellklonzellen zur Verf...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Studie wurde durch einen American Cancer Society Scholars Award (RSG-06-180-01-MBC) und NIH-Zuschüsse (R01 CA143130 und UL1RR029884) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
CD8-T-Zell-IsolationskitMiltenyi Biotec130-094-156
PhytohämaggglutininRemel, Thermo Fisher ScientificR-308528012 mg/Fläschchen
Yssel’s MediumGemini Bio Products400-1021 % humanes gepooltes Serum
Rundboden-96-Well-PlatteBD Biosciences08-772-17
Rekombinantes humanes IL-2R&D Systems202-IL-05050μg
24-Well-PlatteCorning07-200-84
Phosphatgepufferte KochsalzlösungCellgroMT-21-031-CV
Primärer monoklonaler Anti-IFN-γ-Antikörper (D1K)Mabtech3420-3-1000
Biotin-konjugierter monoklonaler Anti-IFN-γ-Antikörper (7B-6)Mabtech3420-6-1000
Multiscreen HA ELISPOT-PlatteEMD MilliporeMAHA S45 10
DimethylsulfoxidSigma-AldrichD2650100-ml-Flasche
Gepooltes Serum, humanAtlanta BiologicalsS40510HHitzeinaktivierung
RPMI 1640CellgroMT-10-040-CV
Tween-20Sigma-AldrichP2287-100ml
Vectastain Elite ABC KitVector LaboratoriesNC9313719
Stabiles DiaminobenzidinOpen BiosystemsMBI 1241
AID EliSpot Reader ClassicAutoimmun Diagnostika GmbHELR06

Referenzen

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Interferon Gamma ELISPOT AssayCharakterisierung von T Zell EpitopenHPV 16 E6 E7 Proteineantigenspezifische T Zell IsolationNachweis der IFN gamma SekretionPr sentation durch autologe LCLsepitopspezifisches T Zell KlonierenHLA Klasse I RestriktionKreuzreaktivit t von HPV Typenminimale optimale Peptidsequenz
Verwendung von Interferon-γ enzyme-linked immunospot Assay zur Novel T-Zell-Epitope des humanen Papillomvirus Charakterisieren
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