Die stereotypen Projektionen von sensorischen Afferenzen in das Nagetier Rückenmark bieten eine leicht zugängliche experimentelle System zur axonalen Verzweigung durch die Verfolgung einzelner Axone zu studieren.
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Methodenartikel
DiI-Markierung von DRG-Neuronen zu Study Axonal Branching in einer Whole Mount Vorbereitung von embryonalen Maus-Spinal Cord
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Hier präsentieren wir eine Technik, um die Flugbahnen der kleinen Gruppen von DRG-Neuronen in den embryonalen Rückenmark Label diffusive Färbung unter Verwendung des lipophilen Tracer 1,1 '-Dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine Perchlorat (DiI) 1 . Der Vergleich der axonalen Bahnen von Wildtyp-mit denen der Maus Zeilen, in denen Gene mutiert sind erlaubt die Prüfung für eine funktionale Rolle der Kandidaten-Proteine in der Kontrolle des axonalen Verzweigungen, die ein wesentlicher Mechanismus in der Verdrahtung des Nervensystems ist. Axonal Verzweigung ermöglicht ein einzelnes Neuron mit mehreren Zielen verbinden, wodurch die physikalische Grundlage für die parallele Verarbeitung von Informationen. Ramifications bei mittleren Zielregionen des axonalen Wachstums kann von Endverzweigung unterschieden werden. Darüber hinaus kann in verschiedenen Modi axonale Verzweigung Bildung abhängig davon, ob Verzweigung ergibt sich aus der Tätigkeit des Wachstums Kegel (Splitting oder verzögert BH klassifiziert werdennching) oder aus den Knospen von Sicherheiten aus dem Axon Welle in einem Prozess namens interstitielle Verzweigung 2 (Abb. 1).
Die zentralen Projektionen von Neuronen aus dem DRG bieten ein nützliches experimentelles System, um beide Arten von axonalen Verzweigung Studie: wenn ihre afferenten Axone erreichen die Spinalganglien entry zone (Drez) des Rückenmarks zwischen embryonalen Tage 10 bis 13 (E10 - E13) sie Anzeige einer stereotypen Muster von T-oder Y-förmigen Verzweigung. Die beiden entstehenden Tochterzellen Axone dann in rostralen oder kaudalen Richtungen gehen jeweils an der dorsolateralen Rand der Schnur und erst nach einer Wartezeit Sicherheiten sprießen aus diesen Stammzellen Axone in die graue Substanz (interstitielle Verzweigung) und Projekt-Relais Nervenzellen in bestimmten eindringen Laminae des Rückenmarks, wo sie weiter verzweigen (Klemme Verzweigung) 3. DiI Kurven haben das Wachstum Kegel an der Spinalganglien Eingangszone des Rückenmarks, die in der pr sein schien enthülltocess der Aufspaltung darauf hindeutet, dass Bifurkation durch die Spaltung des Wachstums Konus selbst 4 (Abb. 2) verursacht wird, jedoch auch andere Optionen, wie gut 5 diskutiert worden.
Dieses Video zeigt zunächst, wie man das Rückenmark von E12.5 Mäusen Verlassen des DRG befestigt sezieren. Nach der Fixierung des Prüflings winzige Mengen DiI angewendet werden, um DRG mit Glas Nadeln aus Kapillaren gezogen. Nach einer Inkubationszeit Schritt wird der markierte Rückenmark als ein umgekehrtes Open-Book Vorbereitung auf einzelne Axone mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert montiert.
Protokoll
1. Dissection Verfahren
Hinweis: Experimentelle Verwendung von Mäusen sollten amtlich zugelassen folgen Richtlinien für die Pflege und Nutzung von Labortieren.
- Vor der Präparation, richten Sie Ihren Präpariermikroskop und legen die chirurgischen Instrumente für die Präparation, darunter grosse und kleine Schere, große Zahn-Zange, einer gebogenen Pinzette und vier Gruppen von Dumont No.5 Pinzette (von denen zwei inside-polierte Spitzen haben) notwendig ( für Details siehe die Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte). Legen Sie ein Blatt Filterpapier in ein 100-mm Sylgard-beschichtete Petrischale. Gießen Sie kalte....
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Diskussion
Stereotype Projektionsmuster aus beiden Arten von axonalen Verzweigung Bildung zusammen mit einfachen Herstellung in Kombination mit der Verwendung von fixiertem Gewebe für DiI Kennzeichnung macht die embryonalen Rückenmarks mit angeschlossenem DRG ein günstiges Modell zu studieren axonale Verzweigung. Die Anwendung von kleinsten Mengen an DiI mit beschichtetem Glas Nadeln ermöglicht - im Gegensatz zu den Bulk-Kennzeichnung von DRG - die Visualisierung von kleinen Gruppen von DRG-Neuronen und damit die Analyse einzelner.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Die Autoren danken Dr. Alistair Garratt (Max-Delbrück-Centrum, Berlin) für hilfreiche Kommentare. Diese Arbeit wurde von der SFB (SFB665) von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare (optional) |
| Stereomikroskop Stemi DR Kongo | Zeiss | ||
| Phosphat-gepufferte Lösung (PBS) | Biochrom AG | L182-50 | |
| Paraformaldehyd | Merck | 8.18715.1000 | |
| Standard-OP-Schere | Feine Science Tools | 14001-13 | |
| Zahnriemen Standard Pinzette | Feine Science Tools | 11021-14 | |
| Extra fine Iris Schere | Feine Science Tools | 14088-10 | |
| Gebogene Pinzette | Feine Science Tools | 11003-13 | |
| Dumont No.5 feinen Spitzen einer Pinzette | Feine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont No.5 Hochglanz Zange | Feine Science Tools | 11252-23 | |
| Vannas-Tübingen Frühjahr Schere | Feine Science Tools | 15008-08 | |
| Filterpapier | Fisher Scientific | FB59041 | |
| Sylgard 184 | Welt Precission Instruments | SYLG184 | |
| 100-mm-Petrischalen | Greiner | 663102 | |
| 12-ml Polypropylen-Röhrchen | Carl Roth GmbH | ECO3.1 | |
| 12-Well-Zellkulturplatten | Becton Dickinson | 35-3043 | |
| Ethanol | Merck | 1.00983.2500 | |
| Flaming / Brown Mikropipette Puller P-97 | Sutter Instrument Co. | ||
| Borosilikatglas Kapillaren | Harvard Apparatus | 30-0066 | |
| DiI (1,1 '-Dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethyl - indocarbocyanine Perchlorat) | Sigma-Aldrich | 468495 | |
| Objektträger SuperFrost Plus | Carl Roth GmbH | H867.1 | |
| Glasdeckgläschen | Carl Roth GmbH | 1870,2 |
Referenzen
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).
- Acebes, A., Ferrus, A. Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites. Trends. Ne....
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Nachdrucke und Genehmigungen
