Summary
Biz, glukozamin ve toprak ekstrakte muramic asit aldonitrile asetat türevlerinin GC-bazlı analizi için bir yöntem tarif protokolü. Kimyasal mekanizmasının aydınlatılması için, biz de türev ve elektron iyonizasyon halinde oluşan iyon parçalarının yapısını onaylamak için bir strateji sunmak.
Abstract
Karakterize eden mikroorganizmalar nicel yaklaşımlar ekosistemler içindeki mikrobik durumu ve işlevini daha geniş bir anlayış için çok önemlidir. Mikrobiyal analiz için güncel yaklaşımlar, geleneksel laboratuvar kültür-bağımlı teknikleri ve doğrudan çıkarma ve bazı biyo 1, 2 belirlenmesi esasına dayanan bu iki içerir. Toprak yaşayan mikrobiyal türlerin çeşitliliği arasında çok az kültüre, dolayısıyla kültür-bağımlı yöntemleri önemli önyargıları, biyomarker analizinde eksik bir sınırlama tanıtmak edilebilir.
Glukozamin, mannosamine, galaktosamin ve muramic asit de toprak sistemleri 3 en önemli unsurlar olan bu glukozamin (en bol) ve muramic asit (benzersiz bakteri hücre dan), canlı ve ölü mikrobiyal kütle hem tedbirler olarak hizmet edilmiştir , 4. Ancak, analiz konusunda bilgi eksikliği bilimsel emsalleri arasında geniş yaygınlaşması kısıtlar. Tüm exi arasındaaldononitrile için, türevlendirme analitik yöntemler sting GC tabanlı analizi takip asetatlar optimum hassas dengeleme açısından iyi bir seçenek olarak ortaya çıkmıştır, hassasiyet, basitlik, numune saklama 5 üzerinde iyi kromatografik ayırma ve kararlılık.
Burada, aldononitrile asetatlar onların dönüşüm sonra topraktan glukozamin ve muramic asit güvenilir ve nispeten basit bir analizi için detaylı bir protokolü sunarız. Protokolü, dört adımdan oluşmaktadır: asit sindirim, örnek arıtma, türevlendirme ve GC belirlenmesi. Adım adım prosedürü eski yayınları 6, 7 göre ayarlanır. Buna ek olarak, yapısal olarak elektron iyonizasyon üzerinde oluşmuş türevi ve iyonu parçacıkları moleküler iyon doğrulamak için bir strateji sunulmaktadır. Biz aldononitrile asetat türevlendirilmiş glukozamin ve mur moleküler ağırlıkların belirlenmesi için GC-MS-EI-SİM, LC-ESI-TOF-MS ve izotopik olarak etiketlenmiş bir reaktif uygulananAmic asit; her türevleri 8 iyonu parçacıkları araştırmak için iyon spektrumunda izotop etiketli türevlerinin kütle kayma kullanılır. Teorik aydınlatılması ek olarak, türev ve iyonu parçacıkları moleküler iyon doğrulama δ 13 C ya da biyokimyasal çalışmalarda 9, 10, bu biyolojik iyon parçaları araştırmacılar kullanılarak yararlı olacaktır.
Protocol
1. Numune Hazırlama ve Asit Ekstraksiyon
- Freeze-kuru toprak örnekleri alan koleksiyon sonra.
- Bir bilyalı değirmen, toprak değirmeni veya bir havanda kullanarak toprak örnekleri eziyet ve homojenize.
- 25 ml'lik hidroliz balona toprak örnekleri (> 0.3 mg N içeren) tartılır.
- Her hidroliz balona 10 ml 6M HCl ekleyin, sıkı N 2 şişe gaz ve kap doldurun.
- Otomatik zamanlayıcı anahtarı kullanarak 8 saat boyunca 105 ° küvözde C'de hidroliz.
2. Örnek Arıtma
- Inkübatör gelen şişeler çıkarın; oda sıcaklığına kadar soğutulur.
- Dönen karıştırın, her balona 100 mcL iç standart myo-inositol (suda 1 mg ml -1) ekleyin.
- ST / NS 24 / istikrar için plastik bardaklar ayarlanan 40 eklem, 200 ml armut şeklinde matara drene plastik huni ayarlayın.
- Katlama Whatman # 2 Kalitatif Circles (11 cm çapında) mahalle ve huni içine setine. Swirl her hidroliz şişesi, ve (daha fazla su ~ 3 mL Her balona durulayın olabilir) filtre hunisi içine şerbeti dökün.
- ~ 45 ° C'de, vakum uygulanarak bir döner buharlaştırıcı kullanılarak Filtrat kuruyana.
- 3 ~ 5 mL su (ve istenirse ultrasonik banyoda kullanan) ile her bir armut şişesi kurutulmuş tortu tekrar süspansiyon, ve bir 40 mL Teflon tüpüne dökülür; suyun ikinci bir kısım ile birlikte şişeye durulanır.
- 6.8 çökelti metal iyonları ve diğer organik molekülleri 1M KOH çözeltisi kullanılarak - 6.6 pH ayarlayın.
- 10 dakika boyunca 2000 rcf santrifüj ile tortulaşır çıkarın.
- Bir 40 mL cam tüp içine dökülür süpernatan, -20 azından tüp parafilm olan açıklığı, dondurularak ° C kapsayan, daha sonra parafilm delikler karıştırmak.
- Tüm sıvı kaldırmak için dondurulmuş süpernatant dondurun-kurulayın.
- , 3 ml kuru metanol ile Kalıntı çözünmesi (ve istenirse ultrasonik banyoda kullanmak) iyice vorteks; kap tüpü ve sonra getirilmesi için 10 dakika süreyle 2000 rcf santrifüjlenirtuzları dışarı.
- Bir 3 mL konik bir reaksiyon şişesi için süpernatan aktarılması; 45 ° C (veya arzu edildiği takdirde, kuru azot gazı akımı altında yumuşak) azından RapidVap makine tarafından kuruyana kadar buharlaştınlmıştır.
- Her flakon için, 100 uL kurtarma standart N-metil-(suda 1 mg ml -1) ve 1 mL H 2 O eklemek -20 flakon parafilm ağızlara, donma ° C kapsayacak, parafilm delebilir ve sonra kuru dondurma .
- Standartları hale: 100 uL muramic asit (metanol içerisinde 0.5 mg mL -1), 100 uL glukozamin (su içinde 1 mg mL -1), 100 uL myo-inositol (su içinde 1 mg mL -1), 100 uL N-ekleme metilglukamin (su içinde 1 mg mL -1), ve 1 ml H2O, parafilm herbir şişe, -20 ° C'de dondurulmuş, daha sonra dondurularak kuru, parafilm perfore.
3. Türevlendirme
- 32 mg mL -1 hidroksilamin hidroklorür ve 40 mg mL -1 4-dimetilamino-py içeren türevlendirme reaktifi hazırlamakin ridine piridin-metanol (4:1 v / v).
- Kapağı sıkıca ve iyice girdap, reactivials her birine türevlendirme reaktifi 300 uL ekleyin.
- 35 dakika boyunca 75-80 ° C su banyosunda (de herhangi bir su şişeleri girmesine izin vermemek için flakon mühürlü) içinde şişeleri koyun.
- Su banyosu, ve oda sıcaklığında serin şişeleri çıkarın.
- 3 mL reactivials, sıkı bir şekilde kap, ve iyice vorteks her birine 1 mL asetik anhidrit ekleme, daha sonra 75-80 dakika boyunca 25 ° C'de su banyosu içinde yeniden ısıtma.
- Su banyosu, ve oda sıcaklığında serin şişeleri çıkarın.
4. Ayırma ve Ölçüm
- Her flakon, kapağı sıkıca ve iyice girdabına 1.5 mL diklorometan ekleyin.
- Çözümler iki sözcük ayrı kadar rahatsız oturup bekleyin Her flakon için, kapağı sıkıca ve iyice girdabına 1 ml 1M HCl ekleyin, aspire ve 1000 uL pipet kullanarak üst (sulu) faz atın.
- Aynı fashion, organik faz 3 kez ayıklamak 1 ml H 2 O ile (son yıkama adımla, sulu üst aşaması tüm kaldırıldı sağlamak için özel dikkat).
- 45 de RapidVap kullanarak nihai çözelti kurumaya ° C (ya da kuru istenirse azot gazı kullanarak).
- 300 uL, etil asetat-hekzan (1:1 v / v) ve küçük hacimli ve sıkı bir şekilde uç kapaklı 2 mL amber vida kapaklı küçük şişelerden transfer çözünmüştür.
- ; Sabit faz% 5-fenil,% 95 metil-polisiloksan (DB-5 veya eşdeğeri) hidrojen ile 30 m uzunluğunda, 0.25 mm 0.25 um film kalınlığı: ölçümü için, erimiş silika apolar kapiler kolon kullanılarak GC-FID tarafından analiz veya helyum taşıyıcı gaz olarak, 0.5 mL min -1 sabit debide. Kromatografisi prim "etkisiz" fazları ve hidrojen taşıyıcı gaz daha iyi, ama daha yaygın çeşitleri ve helyum ile kabul edilebilir. Dedektör 300 ayarlar ve bunlar ° C; 400 mL dak -1 hava ve 30 mL dak -1 nitrojen ve hem dehidrojen makyaj gazlar. Enjeksiyon ve fırın parametreler şunlardır: ° C, 250 GC girişi ile 1 uL bölünmüş enjeksiyon (30:1); ilk fırın sıcaklığı 120 ° C; 1 dakika tutun; 10 fırın sıcaklığı artırmak ° C min. -1 ila 250 ° C; 2.5 dk tutun;. 270 rampa ° C ile 20 ° C min -1; 2 dakika tutun; 290 rampa ° C ile 20 ° C min -1, 5 dakika tutun. Taşıyıcı gaz akış hızını ayarlama böylece 250 ° C'de inositol, glukozamin ve muramic asit türevleri elüt edilmesi, ve 270 de N-metilglukamin elutes ° C.
5.. Türev Doğrulama
- Moleküler iyon tanımlamak ve türevinin moleküler ağırlıkların belirlenmesi için yumuşak bir iyonizasyon LC-ESI-TOF-MS kullanabilir.
- Türevin hedeflenen iyonları araştırmak için duyarlılık geliştirme için GC-EI-MS-SIM veya GC-EI-MSMS kullanın.
- Türevlerinin hazırlanması için birden çok izotopik olarak etiketlenmiş bir reaktif kullanmak ve sonra kütle kayma kullanımıMS olanlar izotopik olarak etiketlenmiş türevlerinin molekül iyonu ve iyonu parçacıkları incelemek.
6. Temsilcisi Sonuçlar
Yöntemin protokolü esas olarak dört adımları ihtiva etmektedir: sindirimi asit, Örnek saflaştırma, türevlendirme ve GC tayini (Şekil 1). Glukozamin ve standart stoktan ve bir toprak örneğinden muramic asit analizi için bir örnek, Şekil 2'de gösterilmiştir. Glukozamin ve muramic asit, mannosamine ve galaktosamin (glukozamin iki izomerler) yanı sıra, aynı zamanda yöntemi kullanılarak eş zamanlı olarak tespit edilebilir. İç standart myo-inositol ile ilgili standartların yanıt faktörlere dayanarak, toprak örneklerinde bu biyobelirteçleri ölçmek olabilir. Kurtarma standart nitelik türevlendirme sürecini izlemek üzere kullanılmıştır. Aldononitrile asetat türevlendirilmiş glukozamin ve muramic asit oluşumu için şemalar Şekil 3 'de gösterilmiştir
Türevlerinin önerilen yapılar duyarlılığı geliştirme, ya da yumuşak iyonizasyon LC-ESI-TOF-MS 8 için GC-EIMS-SIM ile belirlenmiştir; elektron iyonizasyon üzerinde oluşmuş iyon parçalarının önerilen yapıları arasında iyon spektrumu karşılaştırarak incelenmiştir örnekleri, çeşitli izotop birleşmeleri 11 ile hazırlanır. Şekil 4, baskın iyon kütle kayması göstermektedir non-etiketli ajanlar, D-asetik anhidrit ve U -13 C-glukosamin ile hazırlanan üç senaryo, in aldononitrile asetat türevlendirilmiş glukozamin m / z 187. Diğer bilgi ve açıklamalar bizim son yayınları 8, 11 sevk edilebilir. Bu strateji, türev kimya okumak için bir model olarak hizmet verebilir.
Glukozamin analizi ve toprak muramic asit protokolü Şekil 1. Ölçüm akış şemasıörnekleri. Asit sindirim, Arıtma, türetme ve GC belirlenmesi: protokolü, 4 adımları içerir.
Şekil 2. Standartlara ve toprak için inositol, glukozamin, muramic asit, mannosamine, galaktosamin ve metilglucamin ve aldononitrile asetatlar GC-FID kromatogramları.
Şekil 3. Aldononitrile asetat türevlendirilmiş glukozamin ve muramic asit oluşumu için Şema. 1 numara nitril reaksiyonu temsil eder. 2 numaralı asetilasyonu temsil eder.
Şekil 4. Baskın iyon structur ile ilişkili aldononitrile asetat türevlendirilmiş glukozamin Kütle spektrumlarıEI modu altında es (A) non-etiketli maddeleri ile hazırlanmıştır, (B), D-asetik anhidrit, (C) U -13 C-glukosamin. Yıldız ağır izotop atomu veya izotop grubu temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aldononitrile asetat türevlendirilmiş glukozamin ve muramic asit analizi için sunulmuş GC-bazlı yöntem toprak ekstrakte bu amino şekerler, ölçmek için göreceli olarak hızlı bir yöntem sağlar. Türevleri kimyasal açıdan kararlı olan ve bir analize tespit edilebilir. Yöntemi toprak örnekleri ile sınırlı değildir, ve non-toprak matris örnekler için basitleştirilmiş olabilir.
Bu yöntemde kullanılan vakum pompası aside dirençli olması için yapılmıştır. Biz daha 6M HCI çözümler buharlaşan zaman pompaları korumak için bir üs tuzak kurma öneririz. Bakım reaktifler ve cam eşya hem de titiz bir şekilde susuz koşulları sağlamak için türevlendirme adımları sırasında alınmalıdır. Çalışması gecikmeden yapılmalıdır. Züccaciye ya 550 ° C'de muffling veya çözücü ile durulama, titizlikle temiz olmalıdır. Güvenlik önlemleri asitler ve buharlaşma sırasında kuvvetli asit buharları işleme için alınmalıdır. Aminoglikosit, birToprakta yaşayan organizmalar tarafından üretilen bir antibiyotik dizisi, bu DB-5 12 glukozamin ya muramic asit ile eş-elutes, farklı bir sabit faz kimyası ile ikinci bir sütun tavsiye edilir, böylece, olası bir girişim olarak tespit edilmiştir GC-FID halinde Bu amino şekerler ölçülmesi için kullanılan primer yöntemdir. Biz gelecek analizi için GC elutes izleyen bir doğrulayıcı dedektörü öneririz. Karmaşık matrislerde iz biyomarker açık kimliği için, birden fazla reaksiyon izleme ile sofistike enstrümantasyon, örneğin GC-MSMS kullanmanızı öneririz; interferents varlığında biyobelirteç hassas ölçümü için, biz biyomarker özgü bazı hakim kitle iyonları dayalı kalibrasyon yapıyor öneririz türevleri.
Şeker yapısı kimliklerin doğrulanması 15 N-hidroksilamin hidroklorür yerine kondu, asetik anhidrit Döteryumlanmış ve 13 C ve non-etiketli hidroksil için / ya da 15 N etiketli biyobelirteçleramin hidroklorür, türevlerinin hazırlanması içinde asetik anhidrid ve belirteçler, ve daha da izleme etiketsiz türevleri karşılık etiketli karakteristik iyonlarının m / z kayma tahmin. Asetat grubun her 3 deuteriums içerir ve her nitril grup 1 15 N atomu içeren bu yana özel olarak, bu iyon m / z kitle vardiya asetat grupları ve nitril grubu iyon yapıları sunulacak kaç karar olduğu tahmin edilebilir parçaları. Benzer şekilde, 13 C ve / veya 15 N-etiketleme bakteriyel hücre hem kaç C atomlu fragmanı iyon yapılarda glukozamin ya muramic asit kaynaklanan belirlemek için kullanılabilir, ya da glukozamin-N ya da muramic asit-N olup olmadığını fragmanı yapıları.
GC-EI-MS-SIM elektron etkisi iyonlaşma ve kuadrapol kitle ayırma ve seçilmiş iyon izleme kullanarak kütle spektrometresi ardından gaz kromatografisi ise; LC-ESI-TOF-MS elektronik takip sıvı kromatografisi olduğunutrospray iyonizasyon ve zaman-of-flight kütle ayırma kullanarak kütle spektrometresi. Biz burada molekül ağırlığı ve iyon parçaları belirlemek için kullanılan bu yöntemler arasındaki fark olduğunu belirtiyorlar. ESI-MS-TOF herhangi parçalanma oluşur, böylece yeterince düşük bir analit molekülleri kazandırılan iyonizasyon enerjinin bir "yumuşak iyonizasyon" bir tekniktir ve üretilen sinyal analitin moleküler ağırlıktaki bir son derece hassas ölçüsüdür. GC-EI-MS, daha fazla enerji analit aktarılır, ve molekül birbirinden tahsil fragmanları bir dizi sonuçlanacak kırılır. Kuadrapol belirli bir kütle / yük oranı sadece bu fragmanlar detektörü ulaşacak şekilde bir kütle filtre görevi görür. Analitin karakteristik fragmanları, dağılımını yoğunluğu veya bolluk m / z karşı gösterilmiştir hangi bir iyon spektrumu, adı verilen bir grafiktir 'de gösterilmiştir. Duyarlılığını artırmak için, biz MS sadece birkaç belirli m / z değerleri ra toplamak için programlamak içinde, seçilen iyon izleme (SIM) kullanabilirsiniztüm kütle spektrumu daha Ther.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma DOE Great Lakes Biyoenerji Araştırma Merkezi (DE-FC02-07ER64494 Bilim DOE BER ofis) bağışları ile desteklenmiştir. Biz Dr Xudong Zhang ve protokol tamamlanmasına yardımcı teknik tartışmalar ve değerli yorumlarınız için kendi grubunun üyelerine minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Muramic acid | Sigma-Aldrich | M2503-25MG | |
| D-(+)-glucosamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G1514-100G | |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004-500G | |
| Myo-inositol | Fisher Scientific | A307003G025 | |
| Methanol (dry) | Acros Organics | AC326950010 | |
| 4-dimethylamino-pyridine | Acros Organics | AC148270050 | |
| Ethyl acetate | VWR international | BJGC100-4 | |
| Hydroxlamine hydrochloride | Fisher Scientific | H330-100 | |
| Pyridine | Fisher Scientific | P368-500 | |
| Acetic anhydride | Fisher Scientific | A10-100 | |
| Dichloromethane (Methylene chloride) | Fisher Scientific | D37-500 | |
| Hexane | Fisher Scientific | H303-4 | |
| Hydrochloric acid (6M) | Fisher Scientific | S456-4 | |
| Hydroxylamine hydrochloride-15N | Icon services | IN5280 | |
| Acetic anhydride-2H (D6C4O3) | Acros Organics | AC174670050 | |
| D-glucose-U-13C | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1396-1 | |
| Ammonium sufate-15N | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-713-1 | |
| Rapid-Vap | Labconco Corp. | 790002 | |
| Vacum pump | KNF Neuberger | D-79112 | |
| Hydrolysis flask | Fisher Scientific | 06 423A | |
| Derivatization microvial | Fisher Scientific | 06-100E | |
| GC | Hewlett-Packard | 6890 | |
| MS | Hewlett-Packard | 5972 | |
| LC-ESI-TOF-MS | Agilent Technologies | An Agilent 1200 series HPLC system coupled to an Agilent LC/MSD-TOF |
References
- Zelles, L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biology and Fertility of Soils. 29, 111-129 (1999).
- Kirk, J. L. Methods of studying soil microbial diversity. Journal of Microbiological Methods. 58, 169-188 (2004).
- Joergensen, R. G., Emmerling, C. Methods for evaluating human impact on soil microorganisms based on their activity, biomass, and diversity in agricultural soils. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 169, 295-309 (2006).
- Guggenberger, G., Frey, S. D., Six, J., Paustian, K., Elliott, E. T. Bacterial and fungal cell-wall residues in conventional and no-tillage agroecosystems. Soil Science Society of America Journal. 63, 1188-1198 (1999).
- Amelung, W. Assessment Methods for Soil Carbon. Lal, R., Kimble, J. M., Follett, R. F., Stewart, B. A. , CRC/Lewis Publishers. Boca Raton, FL. 233-270 (2001).
- Guerrant, G. O., Moss, C. W. Determination of monosaccharides as aldononitrile, O-methyloxime, alditol, and cyclitol acetate derivatives by gas-chromatography. Analytical Chemistry. 56, 633-638 (1984).
- Zhang, X., Amelung, W. Gas chromatographic determination of muramic acid, glucosamine, mannosamine, and galactosamine in soils. Soil Biology and Biochemistry. 28, 1201-1206 (1996).
- Liang, C. Investigation of the molecular ion structure for aldononitrile acetate derivatized muramic acid. Journal of Microbiological Methods. 86, 224-230 (2011).
- He, H., Xie, H., Zhang, X. A novel GC/MS technique to assess 15N and 13C incorporation into soil amino sugars. Soil Biology and Biochemistry. 38, 1083-1091 (2006).
- Glaser, B., Gross, S. Compound-specific delta 13C analysis of individual amino sugars - a tool to quantify timing and amount of soil microbial residue stabilization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 19, 1409-1416 (2005).
- Liang, C., Balser, T. C. Mass spectrometric characterization of amino sugar aldononitrile acetate derivatives used for isotope enrichment assessment of microbial residues. Soil Biology and Biochemistry. 42, 904-909 (2010).
- Liang, C., Pedersen, J. A., Balser, T. C. Aminoglycoside antibiotics may interfere with microbial amino sugar analysis. Journal of Chromatography A. 1216, 5296-5301 (2009).
