Isolierung von löslicher und unlöslicher PrP Oligomere in das normale menschliche Gehirn

Ein. Vorbereitung der Hirnhomogenat und Waschmittel-Soluble (S2) und-unlöslich (P2) Fraktionen

1. Nehmen 100 mg gefrorenes menschliches Gehirngewebe und 100 ul Lysepuffer (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% EDTA, pH 7,4).
2. Homogenisieren auf Eis mit Pistill durch ein schnurloses angetrieben, frieren sie in Trockeneis für 5 min und homogenisieren Sie es erneut mit Pistill durch die Hände und dann durch einen Motor angetrieben, und 300 ul oder 800 ul Lysepuffer (dies ist entweder die 20 % oder 10% insgesamt Hirnhomogenat, jeweils).
3. Zentrifugieren 20% oder 10% Gesamt-Hirnhomogenisat bei 1.000 xg für 10 min bei 4 ° C bis Überstand (S1) unter Verwendung einer Tischzentrifuge sammeln.
4. Ultrazentrifuge 10% S1 bei 35.000 rpm (100.000 × g) in einem SW55 Rotor (Beckman Coulter, Fullerton, CA) für 1 Stunde bei 4 ° C. Die Überstände (S2), die das Detergens-löslichen Fraktion in ein sauberes Röhrchen enthalten. Resuspendieren der Pellets, die Detergens-unlöslichen enthaltenFraktion (P2) in 100 ul oder 200 ul Lysepuffer bis 10 machen - oder 5-fach konzentrierte Zubereitung.
5. Für PK-Verdauung, inkubieren der Probe mit den gleichen Mengen an PK bei 50 pg / ml bei 37 ° C für 1 Stunde für beide S2 und P2 Fraktionen. Hinzufügen Phenylmethylsulfonylfluorid bei einer Endkonzentration von 5 mM und gleiche Volumina von SDS-Probenpuffer (3% SDS, 2 mM EDTA, 4% β-Mercaptoethanol, 10% Glycerin, 50 mM Tris, pH 6,8), um die PK Verdau beenden. Man kocht die Proben für 10 Minuten und kühlen diese bei Raumtemperatur für 5 min. Sie sind bereit, für Western-Blot.

2. Velocity Sedimentation in Sucrose Stufengradienten

1. Inkubieren 450 ul 20% S1 mit einem gleichen Volumen von 2% Sarkosyl in H ₂ O für 30 min auf Eis.
2. 0,5 ml jeder von 60%, 30%, 25%, 20%, 15% und 10% Saccharose in ein Rohr mit einem Beckman maximal 5 ml Inhalt.
3. Geladen 0,4 ml S1 auf die Oberseite der 10-60% Saccharose Stufengradienten.
4. Zentrifuge bei 48000 Upm (200.000 × g, SW55 Rotor) für 1 h bei 4 ° C.
5. Collect 283 ul Fraktion jeweils von oben auf das Rohr und 12 Fraktionen erhalten insgesamt.
6. Nehmen Sie 20 ul jeder Fraktion zu einem neuen Eppendorf-Röhrchen, fügen Sie 20 ul Probenpuffer, und kochen für 10 min.
7. Coole Proben für 4 min in der Kapuze, bei 1.000 xg für 1 min und Vortex sie zentrifugieren. Legen Sie die Proben auf einer pre-cast-Gel.

3. Size Exclusion Chromatography

1. Verwenden Superdex 200 HR-Perlen (Pharmacia, Uppsala, Schweden) in einem 1 x 30 cm Säule, um die oligomeren Zustand von PrP Molekülen zu bestimmen.
2. Sieben Molekularmasse Marker (Sigma, St. Louis, MI) einschließlich Dextran blau (2000 kDa), Thyroglobulin (669 kDa), Apoferritin (443 kDa), β-Amylase (200 kDa), Alkoholdehydrogenase (150 kDa), Albumin ( 66 kDa) und Carboanhydrase (29 kDa) sind unabhängig voneinander in den Konzentrationen von Sigma in 200 ul Probenvolumina empfohlen geladen.
3. Das Elutionsvolumen von blauen dextran wird verwendet, um das Hohlraumvolumen (V ₀ = 8,45 ml) und das Gesamtvolumen (V _t = 24 ml) wird durch das Produkt der Anweisung für bestimmen. Die Peak-Elutions-Volumina (V _e) von dem Chromatogramm und fraktionierte Retentionen berechnet. K _av, der Verteilungskoeffizient (Definition Probe Verhalten), berechnet unter Verwendung der Gleichung: K _av = (V _E - V ₀₎ / (V _t - V _0). Die Kalibrationskurve durch Auftragen der K _av der Proteinstandards gegen den log MG des Standards ⁸ bestimmt.
4. Das Molekulargewicht (MW) der einzelnen Spezies in verschiedenen PrP FPLC Fraktionen gewonnen wird gemäß einer Eichkurve mit dem Gelfiltration verschiedener Standards erzeugt ausgewertet.
5. Inject 200 ul S1 in Lysepuffer mit 1% Sarkosyl in die Spalte für jeden Lauf.
6. Chromatographie in einem FPLC-System (GE Healthcare) bei einer Flussrate von 0,25 ml / min und Fraktion durchgeführts von 0,25 ml werden gesammelt, indem ein Fraktionssammler (Amersham Biosciences, RediFrac).
7. Inkubieren 0,125 ml jeder Fraktion mit 0,5 ml vorgekühltes Methanol bei -20 ° C für 2 Stunden.
8. Zentrifuge Proben bei 13.000 × g für 30 min bei 4 ° C in einer Tisch-Mikrozentrifuge. Überstand verwerfen und das Pellet in 20 ul SDS-Probenpuffer wie oben erwähnt, Kochen für 10 min, auf Raumtemperatur abkühlen lassen, laden Sie sie auf einen pre-cast-Gel.

4. Erfassung von PrP durch g5p

1. Die g5p Moleküls (100 ug) (freundlicherweise von Drs. Geoff Kneale und John McGeehan von der University of Portsmouth, UK zur Verfügung gestellt) konjugiert ist 7 x 10 ⁸ Tosyl aktiviert magnetische Kügelchen durch Inkubation 100 ug g5p und 350 ul g5p Perlen in 1 ml Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) bei 37 ° C für 20 Stunden. Attract g5p-Perlen an der Seitenwand des Eppendorf-Röhrchen durch externe magnetische Kraft und entfernen Sie dann alle Lösung. Waschen der Kügelchen mit 1 ml PBS, enthaltend0,1% Rinderserumalbumin (BSA) für dreimal.
2. Inkubieren g5p-konjugierte Kügelchen in 1 ml 0,2 M Tris-HCl, pH 7,4 mit 0,1% BSA bei 37 ° C für 5 Stunden um nicht-spezifische Bindung zu blockieren und dann Waschen der Kügelchen mit 1 ml PBS, enthaltend 0,1% BSA für dreimal wie oben erwähnt. Entfernen Sie die Lösung und 1 ml PBS in die Perlen. Die vorbereiteten g5p Perlen sind für mindestens 3 Monate stabil bei 4 ° C.
3. Die Einnahme von PrP durch g5p wird durch Inkubieren 100 ul S1 Fraktionen oder P2 mit 60 ul g5p konjugierte Kügelchen (10 ug Protein / 6 x 10 ⁷ Kügelchen) in 1 ml Bindungspuffer (3% Tween-20, 3% NP-durchgeführt 40 in PBS, pH 7,5).
4. Nach Inkubation mit ständiger Rotation für 3 Stunden bei Raumtemperatur werden die PrP-haltigen g5p Kügelchen an der Seitenwand des Eppendorfröhrchen durch externe Magnetkraft angezogen, so dass für die einfache Entfernung aller ungebundenen Moleküle in der Lösung.
5. Nach dreimaligem Waschen mit Waschpuffer (2% Tween-20 und 2% NP-40 in PBS, pH 70,5) werden g5p Kügelchen gesammelt und bei 95 ° C für 5 min in der SDS-Probenpuffer (3% SDS, 2 mM EDTA, 10% Glycerin, 50 mM Tris-HCl, pH 6,8).
6. Nach Abkühlen Proben für 5 Minuten bei Raumtemperatur werden die Proben bei 1000 × g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die Überstände sind bereit für Western-Blot.

5. Western Blot

1. Last Proben in der SDS-Probenpuffer auf 15% Tris-HCl-Criterion vorgegossenen Gelen (Bio-Rad) bei 150 V gekocht für ~ 80 min.
2. Die Proteine ​​auf dem Gel auf eine PVDF werden für 2 h bei 70 V überführt.
3. Nach Blockieren Membranen in 5% Milch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung, die 0,01% Tween-20 (TBS-T) werden die Membranen für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit primären monoklonalen oder polyklonalen Antikörper 3F4 (1:40.000) inkubiert, 1E4 (1 : 1000), Anti-N ⁸ (1:6000) oder anti-C ⁸ (1:6.000) zum Sondieren der PrP Molekül.
4. Nach Inkubation mit HRP-konjugiertem Schaf-anti-Maus-IgG an1:3000 oder Esel-Anti-Kaninchen-IgG bei 1:3000 die PrP Bänder sind auf Kodak-Film mit ECL Plus visualisiert, in Übereinstimmung mit dem Protokoll des Herstellers.

6. Repräsentative Ergebnisse

Verglichen mit sporadischer CJD Proben wurde eine kleine Menge an ^C IPRP im P2-Fraktion in normalen Gehirnen erkannt, obwohl die meisten von PrP ^C in der S2-Fraktion (Abbildung 1) wurde gewonnen. Wie zuvor angedeutet ^8, IPRP macht etwa 5-25% des gesamten PrP einschließlich voller Länge und N-terminal verkürzten Spezies.

Analysen unter Verwendung von Saccharose Stufengradienten Sedimentation zeigte, dass die meisten von PrP ^C von nicht CJD Gehirne in den Kopffraktionen 1-3 zurückgewonnen wurde, geringe Mengen an PrP wurden auch in den unteren Fraktionen 9-11 enthalten, die normalerweise große Aggregate ⁸ (Abbildung detektiert 2).

Eine Vielzahl von PrP ^Sc Arten läuteteten aus Monomeren wurden kleine Oligomere zu größeren Aggregaten durch Gelfiltration im Gehirn mit Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (3A) isoliert. Jedoch wurde eine kleine Menge von größeren Aggregaten mit einem Molekulargewicht von mehr als 2.000 kDa auch in unlöslichen Fraktionen von normalen Gehirnen (3C) detektiert. Außerdem wurden Dimere und Tetramere von PrP ^C nicht nur in unlöslichen Fraktionen, aber auch in löslicher Fraktionen (3B und 3C) detektiert.

Nach PK und PNGase Behandlung wurde das PrP durch g5p eingefangen mit dem 1E4 Antikörper, der gegen PrP97-105 ⁸ detektiert. Drei PK-resistentem Kern Fragmenten gefasst PrP * ^20, * ¹⁹ PrP und PrP * ⁷ erkannt wurden, wandern bei ~ 20 kDa, 19 kDa und ~ ~ 7 kDa (Abb. 4, linke Tafel). Es wurde jedoch kein PrP erkannt, wenn der 1E4 Antikörper wurde mit einem synthetischen Peptid, das eine Sequenz hat ident vorinkubiertschen dem 1E4-Epitop (Abbildung 4, Mitte), was darauf hinweist, dass Bands von 1E4 erkannt PrP-Fragmente sind. Zudem ergab die anti-C Antikörper zwei verschiedenen PrP-Fragmente Migration bei ~ 18 kDa (PrP * ¹⁸⁾ und ~ 12-13 kDa (PrP-CTF12/13), zusätzlich zu PrP * ²⁰ (Abbildung 4, rechts).

Abbildung 1. Erkennung von IPRP ^C und IPRP ^Sc. Nach der Behandlung mit PNGase F auf 1/10 des gesamten Reaktionsvolumens bei 37 ° C für 1 Stunde an Glykane vom Protein in voller Länge oder N-terminal verkürzte PrP Spezies in den löslichen und unlöslichen Fraktionen (S2 und P2) getrennt zu entfernen durch Ultrazentrifugation im Gehirn Proben von normalen Kontrolle (CTL) und sporadische CJD (sCJD) wurden mit 3F4 gegen PrP106-112 (links), Anti-N gegen PrP23-40 (Mitte) erkannt wird, und Anti-C gegen PrP220-231 (rechts). In CTL-Proben wird eine kleine Menge von PrP in P2 detektiert, während eine große Menge vorhanden ist in S2. Im Gegensatz dazu wird in mehr PrP P2 als in S2 in sCJD Proben nachgewiesen.

Abbildung 2. Sedimentation von PrP in Saccharose Stufengradienten. PrP in einzelnen Fraktionen aus 1 bis 11 der nicht-CJD Hirnprobe S1 wurde durch Western-Blotting mit 3F4 detektiert. Obwohl die meisten von PrP ^C in Kopffraktionen 1-3 detektiert wurde, wurden kleine Mengen an PrP auch im unteren Fraktionen 9-11 beobachtet. Darüber hinaus ist das Bandenmuster von PrP von oben und unten unterschiedliche: PrP in den Kopffraktionen zurückgewonnen hat eine dominante oberen Bandes, während PrP in den unteren Fraktionen zurückgewonnen hat eine dominante unteren Band. Ein PK-behandelten PrP ^Sc wurde als Kontrolle auf der rechten Seite der Blot geladen.

Abbildung 3. Nachweis von löslichen und unlöslichen ^PrPC Oligomere. Lösliche und unlösliche PrP ^C von normalen menschlichen Gehirne wurden durch Ultrazentrifugation getrennt und anschließend einer Gelfiltration unterworfen sind. Die molekularen Größen von einzelnen Fraktionen wurden durch Ausführen einer Gruppe von Molekularmasse Marker gemessen. (A) PrP ^Sc Arten aus sCJD Hirnproben. Zwei Populationen von PrP Arten wurden entdeckt: Gelfiltrationsfraktionen 49 bis 65 enthalten Monomere und kleine Oligomere, während Fraktionen 27-33 große Aggregate enthalten. Die PrP ^C Spezies aus löslichen Fraktion (S2) (B) und unlösliche Fraktion (P2) (C) von normalen Kontrollen gefunden wurden. PrP wurde mit dem 3F4-Antikörper sondiert. Dimere (Fraktion 55) und Tetramere (Fraktion 51) von PrP wurden nicht nur in P2 aber auch in S2 von normalen Gehirn detektiert sampln (B und C). Große Aggregate wurden nur in P2 des normalen Proben (C) detektiert wird.

Abbildung 4. Erkennung von verschiedenen PK-resistente IPRP Fragmente in g5p angereicherte Präparate aus normalen menschlichen Gehirnen. Proben durch g5p angereichert wurden mit PK und PNGase F vor Westernblotting Sondieren mit 1E4 (linke Tafel), 1E4 mit einem synthetischen Peptid, das eine Sequenz identisch mit dem Epitop 1E4 (Mitte) hatte vorinkubiert behandelt und Anti-C ( rechts). 1E4 erkannt drei PK-resistente PrP-Fragmente genannt PrP * ^20, PrP * ¹⁹ und PrP * ⁷ (links). Nach der Blockierung der 1E4 mit dem Peptid wurden keine PrP ^res erkannt (Mitte), was darauf hinweist, dass die Bänder mit 1E4 erkannt PrP-Fragmente sind. Anti-C ergab zwei zusätzlich PK-resistente PrP-Fragmente genannt PrP * ¹⁸ und PrP-CTF12 /13, zusätzlich zu PrP * ^20.

Keine Interessenskonflikte erklärt.